為探索啤酒生產(chǎn)廢水的資源化利用， 采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)斯達(dá)油脂酵母（Lipomyces starkeyi1809）利用啤酒生產(chǎn)廢水產(chǎn)油脂和化學(xué)需氧量（COD）降解率的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用8 L 的發(fā)酵罐進(jìn)行放大試驗(yàn)和發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析，采用氣相色譜法分析菌體油脂脂肪酸的組成。試驗(yàn)結(jié)果表明：最佳發(fā)酵條件為接種量3%、裝液量130 mL、溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵時(shí)間144 h。在此條件下，菌體生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量、COD 降解率和油脂不飽和脂肪酸指數(shù)（IUFA）分別達(dá)到13.83 g/L、5.25 g/L、37.92%、79.08%和65.46%，較優(yōu)化前分別提高了12.62%，19.32%，5.92%，57.15%和2.36%，優(yōu)化效果顯著。發(fā)酵罐放大試驗(yàn)培養(yǎng)到120 h 時(shí)，菌體生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量和COD 降解率均達(dá)到最大值，分別為13.34 g/L、4.82 g/L、36.13%和85.09%，菌體生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量與正交試驗(yàn)的最優(yōu)水平組合條件下所得結(jié)果相似，其中COD 降解率提高了7.59%，且發(fā)酵周期縮短了1 d。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析表明：COD 降解與菌體生長(zhǎng)同步，屬于與生長(zhǎng)相關(guān)型，而油脂積累則屬于與生長(zhǎng)部分相關(guān)型。

關(guān)鍵詞啤酒生產(chǎn)廢水； 斯達(dá)油脂酵母1809； 微生物油脂； COD； 發(fā)酵條件優(yōu)化

微生物油脂是繼植物油脂和動(dòng)物油脂之后開(kāi)發(fā)出來(lái)的又一油脂新資源。利用啤酒生產(chǎn)廢水培養(yǎng)產(chǎn)油脂酵母， 不僅可獲得作為生物柴油新油源的微生物油脂，而且有助于處理廢水污染問(wèn)題，這對(duì)循環(huán)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境保護(hù)都有重要的意義[1]。啤酒生產(chǎn)廢水主要特點(diǎn)之一是BOD5/CODCr值高， 一般

在50%及以上， 含有大量可被生物降解的有機(jī)物質(zhì)，非常有利于生化處理[2]。2011 年我國(guó)啤酒產(chǎn)量達(dá)到4 898.8 kL，占世界總產(chǎn)量的四分之一，已連續(xù)10 年占據(jù)世界第一[3-4]。在啤酒工業(yè)迅速發(fā)展的同時(shí)， 啤酒生產(chǎn)廢水的排放量和處理量也大幅度增加[5]。啤酒生產(chǎn)廢水富含糖類、蛋白質(zhì)等有機(jī)物，若處理不完全，排入水體會(huì)造成水體污染，同時(shí)也會(huì)造成巨大的資源浪費(fèi)[6]。對(duì)于啤酒企業(yè)來(lái)說(shuō)，充分利用好水資源已成為發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)最重要的內(nèi)容之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)不少研究者對(duì)啤酒廢水的資源化利用進(jìn)行了積極探索，如曲春波等[7]利用啤酒廢水培養(yǎng)小球藻；吳英微[8]用生物燃料電池處理啤酒廢水；張建民等[9]利用不同濃度啤酒廢水培養(yǎng)塔胞藻；鄭愛(ài)榕等[10]利用啤酒廢水養(yǎng)殖螺旋藻；黃世文等[11]利用啤酒廢水開(kāi)發(fā)微生物發(fā)酵培養(yǎng)基；萬(wàn)俊杰等[12]用啤酒廢水培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)絮凝劑。這些研究均取得了良好效果，開(kāi)發(fā)出的新興生物處理術(shù)為啤酒廢水處理和資源化利用提供了新思路。筆者在前期利用啤酒生產(chǎn)廢水培養(yǎng)斯達(dá)油脂酵母產(chǎn)油脂基優(yōu)化的基礎(chǔ)上[13]，進(jìn)一步對(duì)斯達(dá)油脂酵母產(chǎn)油脂和COD 降解的發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以期達(dá)到既能得到較高產(chǎn)量的微生物油脂，又能有效降低廢水的COD 的目的，旨在為啤酒廢水資源化利用和降低微生物油脂生產(chǎn)成本提供1條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料斯達(dá)油脂酵母（Lipomyce starkeyi1809），中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）；啤酒生產(chǎn)廢水，南陽(yáng)天冠啤酒廠。

1.1.2 主要試劑酵母膏、蛋白胨、瓊脂、木糖等為生化試劑；葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、α-乳糖、氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉、尿素、苯酚、3，5-二硝基水楊酸、重鉻酸鉀、CuSO4·5H2O、FeCl3·6H2O、氯仿、石油醚、BF3-乙醚溶液等為分析純?cè)噭?；色醇，梯希?ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品：月桂酸（C12：0）、豆蔻酸（C14：0）、棕櫚酸（C16：0）、棕櫚油酸（C16：1）、硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1）、亞油酸（C18：2）、γ-亞麻酸（C18：3），美國(guó)Sigma 公司。1.1.3 培養(yǎng)基YEPD 固體斜面培養(yǎng)基： 葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 值自然。YEPD 液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，pH 值自然。廢水發(fā)酵培養(yǎng)基：自然沉降24 h 的啤酒生產(chǎn)廢水、木糖28.88 g/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、FeCl3·6H2O 3.0 mg/L、150 μmol/L 的色醇（36 h 后添加），調(diào)節(jié)pH 5.8~6.0。以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下飽和蒸汽滅菌20 min。

1.2 主要設(shè)備與儀器

101-2A 電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SW-CJ-2G 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-B 大型全溫?fù)u床， 蘇州威爾實(shí)驗(yàn)

用品有限公司；DNP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱， 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GF93-7500 多參數(shù)自控發(fā)酵罐，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；TDL-40B 低速離心機(jī)、TDL-40B 高速離心機(jī)， 上海安亭科學(xué)儀器廠；LDZX-50FB 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；-20℃冰箱， 嘉興市德?tīng)栯娖髦圃煊邢薰荆?52N 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C 精密pH 計(jì)， 上海雷磁儀器有限公司；TG328B 精密電子分析天平， 湘儀天平廠；超聲波清洗機(jī)，寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；天美TM 7890ⅡGC 氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）、TM 石英毛細(xì)管柱（25 m×0.25 mm，0.25 μm），上海天美科學(xué)儀器有限公司；浙江大學(xué)T2100 色譜工作站， 浙江大學(xué)智能信息工程有限公司。

1.3 培養(yǎng)方法

菌種活化：從4 ℃冰箱中取出保藏菌種，劃線接種至YEPD 固體斜面培養(yǎng)基，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)36~48 h。種子培養(yǎng)： 活化后的菌體接兩環(huán)于液體YEPD 培養(yǎng)基中（250 mL 錐形瓶中裝液量為50mL），28 ℃，120 r/min 培養(yǎng)36 h。發(fā)酵培養(yǎng)：取培養(yǎng)36 h 的種子培養(yǎng)液，按一定接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中（500 mL 錐形瓶中不同裝液量）， 在不同培養(yǎng)條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，設(shè)定3 個(gè)重復(fù)。

1.4 測(cè)定方法

菌體生物量的測(cè)定：采用干重法[14]；油脂的測(cè)定：采用酸熱法[14]；總糖的測(cè)定：采用苯酚-硫酸法[15]； 還原糖量測(cè)定： 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[16]；總氮的測(cè)定：采用凱氏定氮法[17]；pH值的測(cè)定： 采用PHS-3 精密pH 計(jì)[18]；COD 的測(cè)定：采用重鉻酸鉀法[19]，COD 降解率（%）=（原廢水COD-發(fā)酵后廢水COD）/原廢水COD×100%。油脂脂肪酸組成分析：待測(cè)樣品甲酯化。色譜柱：TM 石英毛細(xì)管柱（25 m×0.25 mm，0.25 um）；柱溫：175 ℃； 氣化溫度：280 ℃； 進(jìn)樣量：0.3～0.5；檢測(cè)器（FID）溫度：270 ℃。脂肪酸通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品定性，用面積歸一法確定相對(duì)含量。不飽和脂肪酸指數(shù)（IUFA）計(jì)算[20]：不飽和脂肪酸指數(shù)（IUFA）=1×單烯酸含量%＋2×二烯酸含量%＋3×三烯酸含量%＋……＋n×n 烯酸含量%。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算：根據(jù)菌體生物量、油脂產(chǎn)量及殘?zhí)橇康脑鰷p，計(jì)算其動(dòng)力學(xué)參數(shù)[21]，動(dòng)力

學(xué)參數(shù)計(jì)算公式：

比生長(zhǎng)速率μ（h-1）=（lnX2-lnX1）/（t2-t1）

底物比消耗速率Qs（h-1）=（S1-S2）/X/（t2-t1）

油脂比生成速率Qp（h-1）=（P2-P1）/（X-P）/（t2-t1）

COD 比降解速率Qc（h-1）=（C1-C2）/X/（t2-t1）

式中，X———菌體生物量（g/L）； S———?dú)執(zhí)橇?

（g/L）；P———油脂產(chǎn)量 （g/L）；C———廢水 COD 值

（g/L）；t———發(fā)酵時(shí)間（h）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用綜合評(píng)分法[22]對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，即將指標(biāo)的結(jié)果換成它們的隸屬度，用隸屬度來(lái)表示分?jǐn)?shù)。隸屬度的計(jì)算方法為：指標(biāo)隸屬度=（指標(biāo)值-指標(biāo)最小值）/（指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：根據(jù)生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量和COD 降解率4 個(gè)指標(biāo)的重要性，確定其權(quán)重分別為生物量0.2、油脂產(chǎn)量0.3、油脂含量0.2、COD 降解率0.3，每個(gè)試驗(yàn)號(hào)的綜合分?jǐn)?shù)=生物量隸屬度×0.2+油脂產(chǎn)量隸屬度×0.3+油脂含量隸屬度×0.2+COD 降解率隸屬度×0.3，滿分為1.00。用統(tǒng)計(jì)軟件SPPS10.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。