雙歧桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)

從圖1 雙歧桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)可知， 所篩選的雙歧桿菌沒(méi)有明顯的延遲期，接種后即開(kāi)始增長(zhǎng)，約2h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8h 左右OD 值趨于平緩， 進(jìn)入穩(wěn)定期。之后進(jìn)入衰亡期， 菌液中的活菌數(shù)有所下降。pH 值變化與OD 值變化相對(duì)應(yīng)， 前8h 下降較快,表明此菌株在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末、穩(wěn)定期初的菌株在冷凍干燥過(guò)程中的存活率比較高，故生產(chǎn)中可將發(fā)酵時(shí)間定為8h。

2.2 雙歧桿菌最適初始pH 值

從圖2 可以看出： 雙歧桿菌最佳初始pH 值為7.2，這可能是因?yàn)殡p歧桿菌發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)酸抑制后期菌量增長(zhǎng)，而弱堿性環(huán)境能中和產(chǎn)生的酸，且雙歧桿菌對(duì)弱堿性環(huán)境有一定適應(yīng)能力，所以雙歧桿菌在弱堿性環(huán)境中生長(zhǎng)較中性環(huán)境好。

2.3 雙歧桿菌最適生長(zhǎng)溫度

如圖3 所示， 雙歧桿菌最適培養(yǎng)溫度為35℃，比原先認(rèn)為的38℃低，所以不能理所當(dāng)然地認(rèn)為腸道細(xì)菌的最佳培養(yǎng)溫度與宿主體溫相同，而應(yīng)通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)加以論證。這個(gè)結(jié)果對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)來(lái)說(shuō)是個(gè)好消息，發(fā)酵溫度低了可節(jié)能。

3.4 雙歧桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化

正交實(shí)驗(yàn)中A、B、C、D 四個(gè)因素，A 是氮源，包括酵母浸膏、胰蛋白胨和大豆蛋白胨；B 為碳源，選用葡萄糖；C 為雙歧因子低聚果糖；D 為生長(zhǎng)因子肝浸液。通過(guò)多次試驗(yàn)得到結(jié)論： 雙歧因子對(duì)雙歧桿菌的影響最為顯著，氮源次之，生長(zhǎng)因子再次之，碳源的影響最小。用OD 值衡量最優(yōu)組合為9，綜合分析得最佳培養(yǎng)基配方為酵母膏0.9%，胰蛋白胨0.6%，大豆蛋白胨0.3%，葡萄糖2.5%，雙歧因子0.3%，生長(zhǎng)因子5%。

3.5 雙歧桿菌與乳酸菌10L 和100L 發(fā)酵罐混合厭

氧發(fā)酵厭氧發(fā)酵的培養(yǎng)基組成為：（標(biāo)紅色的是方法不應(yīng)該放在結(jié)果部分）酵母膏0.9%， 胰蛋白胨0.6%， 大豆蛋白胨0.3%，葡萄糖2.5%，雙歧因子（低聚果糖）0.3%，生長(zhǎng)因子（牛肝浸液）5%。發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基滅菌后調(diào)pH 7.0-7.2。菌種分別于35℃接種到三角搖瓶，35℃培養(yǎng)16h 后，轉(zhuǎn)入100L 發(fā)酵罐，接種總量10％（各5%），發(fā)酵溫度35-36℃，發(fā)酵時(shí)間14-16h，發(fā)酵過(guò)程中緩慢通入混合氣體（氮?dú)?、二氧化碳、氫氣），維持罐壓0.1kg/cm2 以上。100L 發(fā)酵罐的研究結(jié)果見(jiàn)表2，顯示活菌數(shù)均達(dá)到109，獲得了適宜于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)畜用益生菌的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。當(dāng)溶液pH 下降、上升時(shí)， 酶仍能保持這種活性狀態(tài)，使其催化功能所受影響較小。

3.5 修飾尿激酶的蛋白電泳檢測(cè)

圖1 結(jié)果表明經(jīng)肝素修飾的尿激酶分子量為58KDa，明顯高于未修飾尿激酶。且經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠G-100 柱分離純化，條帶單一，可能是由于肝素不適于修飾低分子量的尿激酶，而主要針對(duì)高分子量尿激酶進(jìn)行了有效修飾。低分子量肝素修飾尿激酶迄今國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道，該修飾酶具有高活性、穩(wěn)定性強(qiáng)、無(wú)毒、無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，在體內(nèi)半衰期明顯延長(zhǎng)，可大大提高其臨床療效；并可應(yīng)用于該酶的體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)其臨床應(yīng)用進(jìn)行深入研究。此外，我國(guó)自古有喝人尿預(yù)防和治療血栓等疾病的應(yīng)用，肝素修飾的尿激酶具有較強(qiáng)的抗蛋白酶水解能力，對(duì)熱及pH 亦具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。因此，可將此修飾酶開(kāi)發(fā)為口服制劑預(yù)防心腦血管等疾病， 使其具備更廣闊的應(yīng)用前景。