摘　要：目的　確定超聲波輔助方法提取虎杖中總黃酮的最佳工藝。方法　采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化影響虎杖中總黃酮類成分提取的４種主要因素：提取劑（ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ）濃度、提取溫度、超聲時間以及料液比；并以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣品，利用紫外可見分光光度法測定虎杖中總黃酮的吸光度值，為確定最佳提取條件提供參考。結(jié)果　通過正交實(shí)驗(yàn)得到從虎杖中提取總黃酮的最佳工藝為：乙醇濃度為７５％，超聲溫度為５０℃，超聲時間為３５ｍｉｎ，料液比１∶４０，其提取率可以達(dá)到７．６８％。結(jié)論　通過該實(shí)驗(yàn)確立了虎杖中總黃酮提取的最優(yōu)工藝，提取效果良好、操作簡便易行，節(jié)能環(huán)保。

關(guān)鍵詞：虎杖；總黃酮；超聲提??；正交實(shí)驗(yàn)

虎杖（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ?。悖酰螅穑椋洌幔簦酰?Ｓｉｅｂ．ｅｔ　Ｚｕｃｃ）為蓼科蓼屬多年生灌木狀草本植物，又名斑杖、斑根及紫金龍。主要生長在海拔２　５００ｍ以下比較陰暗潮濕的地方如山溝、溪邊、山坡及林下等，主要分布于我國福建、湖北、陜西及四川等地。虎杖

性寒味苦，它具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗菌、抗病毒、保肝、鎮(zhèn)咳平喘等藥理作用?；⒄鹊幕瘜W(xué)成分比較復(fù)雜，主要包括蒽醌類、二苯乙烯類、酚性成分、黃酮類等［１］。黃酮類化合物是虎杖中含量較少但是具有顯著藥理作用的一類物質(zhì)。黃酮類化合物（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）又稱黃酮體、黃堿素，分布廣泛，具有高度的化學(xué)活性，具有抗氧化自由基、抗菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛活性等。又因?yàn)樗鼰o毒無害，在退變性疾?。ㄈ缧难懿　⒛[瘤等）的治療和預(yù)防上具有良好的應(yīng)用前景。由于黃酮類化合物具有許多的功效，因此受到了科學(xué)家們的廣泛的青睞與重視［２－３］。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道虎杖根所含的黃酮醇苷有利尿作用［４］?，F(xiàn)代藥理研究表明虎杖的黃酮類物質(zhì)還具有降血糖作用，對糖尿病的發(fā)生率和死亡率有降低作用［５－７］。近年來，世界上掀起了開發(fā)植物的熱潮［８］，目前對虎杖中二苯乙烯類和蒽醌類有效成分的研究較多，但對虎杖中總黃酮類成分提取工藝的研究報道相對較少。為了進(jìn)一步開發(fā)虎杖的藥用成分，探索研究先進(jìn)的提取分離方法，加速植物資源的開發(fā)利用，對虎杖黃酮類成分的提取方法的研究是十分必要的。

因此，在查閱各種相關(guān)文獻(xiàn)等資料和總結(jié)前人的研究方法的基礎(chǔ)上，并對它們進(jìn)行研究比較，優(yōu)選出虎杖總黃酮成分提取的最佳工藝，為開發(fā)

福建寧化豐富的虎杖中藥資源作貢獻(xiàn)是本文的目的所在。本文通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波提取虎杖中的黃酮類成分的工藝，并用紫外可見分光

光度計(jì)測量其含量。

１　實(shí)驗(yàn)部分

１．１　原料、試劑與儀器

１．１．１　實(shí)驗(yàn)原料和試劑

虎杖，產(chǎn)于福建寧化；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：德國產(chǎn)；ＮａＮＯ２（ＡＲ），Ａｌ（ＮＯ３）３（ＡＲ），ＮａＯＨ（ＡＲ），９５％乙醇（ＡＲ），石油醚（６０～９０℃，ＡＲ）。

１．１．２　實(shí)驗(yàn)儀器

ＫＱ３２００ＤＢ型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)）；Ｕｖｍｉｎｉ－７２２型紫外－可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）；ＳＨＢ－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)）；ＦＡ１６０４Ｎ型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）；玻璃儀器氣流烘干器（鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司生產(chǎn)）；ＲＴ－０２型藥材粉碎機(jī)（武義縣嶺立工具有限公司生產(chǎn)）。

１．２　分析方法

由于黃酮類成分和蘆丁均有２－苯基色原酮為母核的結(jié)構(gòu)，因此測定總黃酮的含量可以以蘆丁為基準(zhǔn)物，采用Ａｌ（ＮＯ３）３－ＮａＮＯ２

為顯色劑，根據(jù)黃酮類化合物與鋁鹽顯色反應(yīng)生成的有色化合物，采用分光光度計(jì)進(jìn)行虎杖總黃酮吸光度的測定，并分析其含量［９－２１］。

本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選出超聲波法提取虎杖中總黃酮的最佳工藝。

１．３　實(shí)驗(yàn)步驟

１．３．１　備料

首先將原材料虎杖根莖洗凈晾曬、烘干，再粉

碎，過粒度為４２０μｍ篩，備用。

１．３．２　配制溶液

分別配制５％ ＮａＮＯ２溶液，１０％ Ａｌ（ＮＯ３）３溶液，４％ＮａＯＨ 溶液，不同濃度乙醇溶液（４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％）。

１．３．３　待測樣品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取若干份虎杖根莖粉末，每份１．００ｇ，分別置于１２５ｍＬ三角錐形瓶中，用一定濃度的乙醇溶液溶解，避光密封浸泡１２ｈ，再置于超聲波清洗器中提取，趁熱進(jìn)行減壓抽濾，濾液冷卻至室溫后，再轉(zhuǎn)移到１２５ｍＬ的梨型分液漏斗中用石油醚萃取脫脂，下層萃取液用去離子水定容至１００ｍＬ，搖勻，樣品液配制完成，備用。

１．３．４　超聲提取虎杖總黃酮及測定的工藝流程

虎杖根莖干燥→粉碎→過篩（４２０μｍ）→按料液比加入乙醇水溶液浸漬１２ｈ（密封避光）→超聲提取→減壓抽濾→冷卻→用石油醚萃取脫脂

→下層萃取液定容（１００ｍＬ容量瓶）→移取１．００ｍＬ→加入１．０ｍＬ?。担?ＮａＮＯ２溶液→１．０ｍＬ１０％ Ａｌ（ＮＯ３）３

溶液→１０．０ｍＬ?。矗?ＮａＯＨ 溶液→并定容至２５ｍＬ →測定吸光度值→計(jì)算總黃酮提取率。

１．４　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

１．４．１　標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品１０．０ｍｇ（１２０ ℃烘至恒重）至１００ｍＬ容量瓶中，用７０％的乙醇定容。濃度為１００．０μｇ／ｍＬ的標(biāo)準(zhǔn)品溶液配好備用。

１．４．２　最大吸收波長的選擇

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液１．０ｍＬ，待測樣品液１．０ｍＬ，分別移入２５ｍＬ容量瓶中，均加入５％ＮａＮＯ２溶液１．０ｍＬ，搖勻，放置６ｍｉｎ后，再加入１０％ Ａｌ（ＮＯ３）３溶液１．０ｍＬ，搖勻，放置６ｍｉｎ后，再加入４％ＮａＯＨ 溶液１０ｍＬ，用去離子水定容，搖勻，放置１５ｍｉｎ，以未加蘆丁的試液作空白對照。將３種溶液用Ｕｖｍｉｎｉ－７２２型紫外－可見分光光度計(jì)于波長４６０～５２０ｎｍ 范圍測定其吸光度，結(jié)果表明：虎杖提取液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液均在波長為５００ｎｍ處達(dá)到最大吸收值，因此選５００ｎｍ為測定波長［１７］。

１．４．３　標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

精密量取制備的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液各０，１．０，２．０，４．０，６．０，８．０，１０．０ｍＬ，分別移入７只２５ｍＬ容量瓶中，記為１，２，３，４，５，６，７號，均加入５％ＮａＮＯ２溶液１．０ｍＬ，搖勻，放置６ｍｉｎ，再加入１０％ Ａｌ（ＮＯ３）３溶液１．０ｍＬ，搖勻，放置６ｍｉｎ后，加入４％ＮａＯＨ 溶液１０．０ｍＬ，加去離子水至刻度，搖勻，放置１５ｍｉｎ，并以１號為空白，在波長５００ｎｍ下，用紫外－可見分光光度計(jì)測吸光度，以吸光度Ａ 對蘆丁含量Ｃ 作圖，得到回歸方程為：Ａ＝０．００９　９Ｃ－０．００３　９，Ｒ２＝０．９９９　４。結(jié)果見圖１。圖１　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Ｆｉｇ．１?。裕瑁濉。悖幔欤椋猓颍幔簦椋铮睢。悖酰颍觯濉。铮妗。颍酰簦椋睿保矗础』⒄戎锌傸S酮含量測定

準(zhǔn)確吸取虎杖提取液１．０ｍＬ于２５ｍＬ的容量瓶中，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色，并于最大吸收波長５００ｎｍ下測得吸光度并計(jì)算含量。

總黃酮提取率：ｗ（％）＝（Ｃ×２５×１００）ｍ ×１０－６ （１）式（１）中：ｗ（％）為虎杖中總黃酮的提取率（以蘆丁計(jì)）；Ｃ 為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對應(yīng)的虎杖中總黃酮的質(zhì)量濃度（μｇ／ｍＬ）；ｍ 為樣品的質(zhì)量（ｇ）。

１．５　超聲波輔助提取虎杖中總黃酮的影響因素

（１）溶劑濃度：不同濃度的乙醇溶液（４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％）。

（２）超聲作用時間：２０ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，４０ｍｉｎ，５０ｍｉｎ，６０ｍｉｎ，７０ｍｉｎ。

（３）提取溫度：２０℃，３０℃，４０℃，５０℃，６０℃，７０℃。

（４）料液比：１∶１０，１∶２０，１∶３０，１∶４０，１∶５０，１∶６０。

１．５．１　提取總黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取１．００ｇ虎杖根莖粉末，用不同的乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度分別進(jìn)行單因素影響實(shí)驗(yàn)。

１．５．２　提取總黃酮的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了全面考察影響因素，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取各單因素的最優(yōu)條件，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)Ｌ９（３４），確定總黃酮的最佳提取條件［１８－２０］。