目前生物層析用的凝膠大都以瓊脂糖為載體,如Pharmacia 公司生產(chǎn)的Sepharose CL -4B 、CL -6B等, 存在價格昂貴、合成再生較復(fù)雜、需劇毒CNBr活化等缺點。因此, 尋找性能適宜、價格較低的生物層析凝膠已經(jīng)成為生物化工研究的重要課題。殼聚糖是甲殼素脫乙酰產(chǎn)物, 化學(xué)名稱為β--2-氨基-去氧-D-葡聚糖。殼聚糖和瓊脂糖具有生物相容性, 表面基團(tuán)豐富, pH 適用范圍寬 , 作為層析凝膠載體是完全可能的。1988 年, 加拿大Holme 等人研究了在殼聚糖上接上1-β-D-吡喃葡萄糖基, 作為層析凝膠, 其分離效果不令人滿意。1989年, 瑞典Senstad 等人利用殼聚糖作為層析凝膠, 可溶性的殼聚糖和目的蛋白之間分離困難。1991 年,揚州大學(xué)農(nóng)學(xué)院酶工程實驗室報道了用殼聚糖作為載體, 合成了兩種親和吸附劑。生物層析凝膠對生物親和性和分離能力要求較高。隨著生物工程的迅速發(fā)展, 生物凝膠昂貴的價格極大地影響了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。為此, 作者根據(jù)殼聚糖所具有的優(yōu)良性能,采用戊二醛交聯(lián)并去除過量醛基的方法, 制備出了殼聚糖為載體的生物凝膠。作者在殼聚糖生物層析凝膠制備基礎(chǔ)上, 進(jìn)行了層析凝膠洗脫條件的探索及層析凝膠和Sepharose CL -6B 分離性能的比較實驗, 為擴(kuò)大層析凝膠在工業(yè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
隨著NaCl 濃度提高, 殼聚糖生物層析凝膠分離電泳單點純牛血清蛋白峰形產(chǎn)生部分拖尾現(xiàn)象, 可能是隨著氯離子的濃度增大, 增加了載體的疏水作用, 但c(NaCl)=0.05 mol/L 的tris-HCl(pH =9.05)只有很小的拖尾現(xiàn)象, 達(dá)到很好的峰形,而且低鹽濃度有利于蛋白質(zhì)的吸附, 故c (NaCl)=0.05 mol/L 的tris-HCl(pH =9.05)為較好的洗脫體系。洗脫體系pH 對分離效果的影響交換容量與電荷基團(tuán)的數(shù)量, 或者說與溶液的pH 有密切的關(guān)系。帶有強(qiáng)電荷基團(tuán)的離子交換劑由于任何pH 的溶液都處于解離狀態(tài), 所以交換容量基本與pH 變化無關(guān)。為了考察pH 對洗脫效果影響, 通過改變tris-HCl 洗脫體系pH 進(jìn)行實驗。
通過以上實驗, 作者得到殼聚糖層析凝膠最佳洗脫條件:120 ~ 140 μm 殼聚糖層析凝膠裝柱, c(NaCl)=0.05 mol/L 的tris-HCl(pH =9.05)洗脫, 控制2.0 ~ 3.0 mL/min 流速。殼聚糖層析凝膠和Sepharose CL -6B 凝膠對比實驗, 殼聚糖層析凝膠對酶的分離效果較好, 生物親和性優(yōu)良, 酶活回收率>90 %, 分離效果優(yōu)于Sepharose CL -6B 凝膠。