寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA可以定量溶于緩沖液，構(gòu)成核酸的嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，使核苷核和核酸在紫外線(xiàn)光具有特征性的吸收光譜，最大吸收峰為260nm。窄光帶紫外分光光度計(jì)，長(zhǎng)260nm．，比色杯光徑1cm，1個(gè)吸光度值（1A）相當(dāng)于50ug/ml雙螺DNA，40ug/ml單螺旋DNA或RNA），20 ug/ml寡核苷酸。

測(cè)試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。

原理紫外分光光度法基于DNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，DNA/RNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在28Onm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長(zhǎng)進(jìn)行分光測(cè)定核酸濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈 DNA，單鏈DNA濃度約為33ug l ml，RNA約為40ug/ml，寡核苷酸約為35ug/ml。如用1cm光徑，用 H,O稀釋DNA/RNA樣品n倍并以H,O為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度:

DNA (mg/ml ) =50×OD260 讀數(shù)×稀釋倍數(shù)/1000RNA (mg/ml) =40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)/1000。

A280nm是蛋白和酚類(lèi)物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估:純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族)

或分類(lèi)物質(zhì)的污染，需要純化樣品。比值=1.5相當(dāng)于50%蛋白質(zhì)/DNA溶液。

A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估:純DNA和RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標(biāo)明樣品被碳水化合物（糖類(lèi)）、鹽類(lèi)或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。

A320nm或A340nm為檢測(cè)溶液樣品的濁度，該值應(yīng)該接近0.0。假如不足，標(biāo)明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。

儀器及試劑

超微量分光光度計(jì)

比色杯

樣本DNA

雙蒸水

測(cè)定

1、將制備的DNA懸浮溶解于TE緩沖液中 pH8.0，10mmo1L的Tris緩沖液，內(nèi)含(1mmol/L EDTA)或懸浮溶解在滅菌水中(依據(jù)DNA含量加水)。

2、用可掃描的紫外分光光度計(jì)測(cè)定制備的DNA/RNA的紫外吸收曲線(xiàn)，測(cè)定OD260和OD280，并計(jì)算比值:OD260/OD280，純 DNA的此比值約為1.8~2.0。純RNA的此比值

約為大于2.0。

3、根據(jù)每毫升1微克的純DNA的OD260值=0.020，計(jì)算所得 DNA的純度:每毫升1微克的純RNA的OD260值=0.025，計(jì)算所得RNA的純度。

注意事項(xiàng)

OD值范圍應(yīng)該在0.1~0.99之間，否則不符合上述線(xiàn)性關(guān)系。

A260/A280比值可提供DNA純度的一個(gè)參考，但A260/A280比值會(huì)受pH影響。如果未調(diào)pH，比值可能與實(shí)際差別很大。如果需要準(zhǔn)確數(shù)值，建議在10 mM Tris Cl，pH 8.5中檢測(cè)，此時(shí)純凈的 DNA A260/A280比值應(yīng)為1.8-2.0（注意應(yīng)使用同樣緩沖液作為對(duì)照)

在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了最大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過(guò)低，或者過(guò)高（超過(guò)光度計(jì)的測(cè)試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無(wú)懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。