摘要：文章用自制的明膠肽灌胃飼養(yǎng)SD 大鼠實(shí)施營(yíng)養(yǎng)干預(yù)，通過(guò)電刺激方法誘發(fā)動(dòng)物疲勞，在評(píng)價(jià)明膠肽抗疲勞功效的基礎(chǔ)上，檢測(cè)疲勞動(dòng)物前肢腓腸肌肌肉中的ATP含量、ATP酶活性和肌電積分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：和蒸餾水飼養(yǎng)組對(duì)比，明膠肽能延長(zhǎng)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)時(shí)間，降低疲勞后的血乳酸和尿素氮含量，提高肝肌糖原含量，具有顯著的抗疲勞功效；ATP 酶活性實(shí)驗(yàn)組為3.92，對(duì)照組為2.33，ATP 含量實(shí)驗(yàn)組為31.71，對(duì)照組11.58；肌電積分實(shí)驗(yàn)組明顯比對(duì)照組多（2.39＞1.32）；分析以上數(shù)據(jù)，明膠肽抗肌肉疲勞的可能通路是在增加糖原含量的基礎(chǔ)上，作為信使改善ATP酶活性，提高ATP生成量，增強(qiáng)了肌肉的做功能力，達(dá)到抗疲勞功效。

關(guān)鍵詞：明膠抗疲勞肽ATP酶肌電積分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

抗疲勞肽因其安全高效成為近年來(lái)功能食品研究的熱點(diǎn)，但是，相關(guān)研究主要依據(jù)保健食品的功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法中的判定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)活性成分的營(yíng)養(yǎng)功效，對(duì)于作用機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺乏深入分析，從而使相關(guān)產(chǎn)品的市場(chǎng)推廣難以擴(kuò)展，形成開(kāi)發(fā)熱而消費(fèi)不旺的尷尬局面。本研究通過(guò)灌胃飼養(yǎng)明膠肽實(shí)施營(yíng)養(yǎng)干預(yù)在評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)功效的基礎(chǔ)上，檢測(cè)了疲勞動(dòng)物ATP 酶活性、含量和肌電積分，分析信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，希望明確作用機(jī)制，為活性肽抗疲勞機(jī)制的研究和市場(chǎng)應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SD 封閉群無(wú)菌型大白鼠40 只，180～200g；購(gòu)自西安交通大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心。

1.1.2 試驗(yàn)食品與試劑

食品級(jí)明膠（山東淄博寶恩生物科技有限公司提供）；胰蛋白酶（Wolsen）；明膠肽（自制，用胰蛋白酶水解明膠，酶解工藝條件：pH7.2，酶含量為4%，原料的質(zhì)量濃度為4%，水解溫度為44℃，時(shí)間5h，酶解液15%TCA 除蛋白，超濾膜分離、收集不同分子量組分）；血乳酸試劑盒、尿素氮試劑盒、肝（?。┨窃噭┖?、ATP 含量測(cè)定試劑盒、超微量ATP 酶測(cè)試盒（南京建成生物技術(shù)研究所）；其余試劑為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

解剖動(dòng)物手術(shù)器械一套、解剖臺(tái)等；GY-640 四道生物信號(hào)采集系統(tǒng)（開(kāi)封生物儀器廠）；JL-C4 電刺激器（上海嘉龍儀器廠）；JH-21 型肌肉張力換能器器（量程300g，北京新航天醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)）；PHS-3C 型臺(tái)式PH 機(jī)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HHS 型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；TCL-16G 型臺(tái)式離心機(jī)（江蘇省金壇醫(yī)用儀器公司）；JA5103N 型電子天平；FSH-2 型高速勻質(zhì)器；722N 型分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；其余為常規(guī)儀器。

l.2 方法

1.2.1 大白鼠分組飼養(yǎng)

按照體重進(jìn)行隨機(jī)分組，共分成4 個(gè)組，一個(gè)對(duì)照組和三個(gè)試驗(yàn)組。日常自由采食飲水，灌胃飼養(yǎng)28 天，對(duì)照組灌胃雙重蒸水，試驗(yàn)組分別給予不同分子量分布的明膠肽組分（質(zhì)量濃度為2%，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組明膠分子量分布分別為1#＜3KDa、3KDa≤2#＜5KDa、5KDa≤3#＜10KDa），飼養(yǎng)量為動(dòng)物體重的3%。

1.2.2 最適電刺激強(qiáng)度的測(cè)試

將一對(duì)間距2.5mm 的刺激銀絲電極搭在腓腸肌肌腹正中隆起處，與肌纖維走向平行，電極間距0.3cm，電極阻抗是2kΩ；安放電極前用醫(yī)用酒精將安放電極處皮膚進(jìn)行反復(fù)清洗去除表面脂肪，減少電阻誤差。貼電極時(shí)，電極下涂適量導(dǎo)電膏，電極用薄橡膠條包裹固定，電極的另一端與HL-2000 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的輸出端連接。電極使用的刺激從0v 開(kāi)始，刺激強(qiáng)度范圍：0-20v；5-20Hz。隨刺激強(qiáng)度的增加肌肉開(kāi)始收縮，其幅度逐漸增大，當(dāng)刺激強(qiáng)度達(dá)某一個(gè)數(shù)值時(shí)，再增大刺激強(qiáng)度，收縮幅度不再增大。確定引起最大收縮幅度為最適刺激強(qiáng)度。

1.2.3 疲勞動(dòng)物肌電積分的采集、分析和計(jì)算

末次灌胃2h 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，使用HL-2000（4 道）生物信號(hào)采集系統(tǒng)連續(xù)采集sEMG 信號(hào)。信號(hào)采樣頻率為1000Hz，輸入阻抗小于50MΩ，噪聲水平小于1μｖ，A/D 轉(zhuǎn)換12bit，差分放大器的放大倍數(shù)為100 倍，CMMR>100dBt。時(shí)域特征反映表面肌電信號(hào)振幅變化的指標(biāo)是iEMG。頻域特征反映表面肌電信號(hào)功率譜變化的指標(biāo)為MPF 和MF。動(dòng)物分為4 組，用幅度2.0mA（超強(qiáng)刺激）、波寬200uv、頻率是20Hz 的刺激信號(hào)不間斷施于

大白鼠的坐骨神經(jīng)，使同側(cè)的腓腸肌做等長(zhǎng)收縮運(yùn)動(dòng)。肌肉出現(xiàn)強(qiáng)直收縮時(shí)判定為疲勞，停止刺激，用HL-2000 生物信號(hào)采集系統(tǒng)自帶軟件分析表面肌電的平均功率頻率（MPF）、中位頻率（MF）和積分肌電（iEMG）。數(shù)據(jù)采用Spss11. 5 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組別間MPF、MF 以及iEMG 差異檢驗(yàn)分別采用t檢驗(yàn)。P<0.05 為具有顯著性差異，P<0.01 為具有非常顯著性差異。

1.2.4 樣品采集、處理和檢測(cè)

運(yùn)動(dòng)肌肉組織勻漿的制備：將疲勞大鼠放在粗糙的平面上，左手向下按壓頸椎，右手拉住大鼠尾部向后上方拉使頸椎脫臼處死大鼠（考慮化學(xué)麻醉導(dǎo)致組織留存較多血液，同時(shí)檢測(cè)指標(biāo)受化學(xué)試劑干擾影響測(cè)試結(jié)果，避免化學(xué)麻醉處死），在冰面上解剖后剝離取前肢，經(jīng)冰凍生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，加5%TCA 沉淀蛋白，取適量濕組織加生理鹽水按W：V=1：10 在冰浴條件下用組織勻漿機(jī)制成勻漿，組織勻漿時(shí)選擇小刀，肌肉組織控制轉(zhuǎn)速為6000 r/min，時(shí)間為15min。隨后于8000r/min 離心8min ，取上清液，按照衛(wèi)生部衛(wèi)生監(jiān)督司l996 年頒布的“保健食品的功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法”檢測(cè)血乳酸、尿素氮、肝（?。┨窃縖1]。按照試劑盒指定的方法測(cè)定ATP 酶活性和含量。