摘要: 應(yīng)用高效液相色譜原理建立核桃青皮中胡桃醌活性成分的分析測(cè)定方法，該方法的線性回歸方程為y =598 860x － 49 983 ( r2 = 0． 999 1) ，線性范圍為10 ～ 150 μg /mL，該方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，回收率為93． 90% ～ 95． 14%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%。關(guān)鍵詞: 高效液相色譜; 胡桃醌; 核桃; 青皮胡桃醌是核桃青皮中的有效成分，具有抗腫瘤、抑菌及抗病毒、抗氧化等活性，目前已被應(yīng)用于醫(yī)藥方面的研究［1］。高效液相色譜的分離原理與其他色譜法相同，都是利用混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同而被分別分離的原理［2］?，F(xiàn)在使用的微處理機(jī)控制的高效液相色譜儀，其自動(dòng)化程度非常高，不僅能控制儀器的相關(guān)操作參數(shù)( 如溶劑的梯度洗脫、流動(dòng)相流量與流速、柱溫、自動(dòng)進(jìn)樣、洗脫液收集、檢測(cè)器功能等) ，而且還能對(duì)獲得的色譜圖進(jìn)行收縮、放大、疊加，并對(duì)保留時(shí)間和峰高、峰面積進(jìn)行綜合處理，使色譜分析工作者能高效率、高質(zhì)量、高標(biāo)準(zhǔn)地完成分析工作［3］，因此它在天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)的研究及植物藥的發(fā)展中起著非常重要的作用。天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)不像化學(xué)藥品那樣簡單、規(guī)范、物質(zhì)單一，它們不僅有著非常復(fù)雜的成分，而且各種成分之間可能會(huì)相互影響和相互作用。因此，根據(jù)不同的分析對(duì)象、目的以及要求，可以利用高效液相色譜技術(shù)對(duì)天然產(chǎn)物某一成分化合物建立高效、靈敏、準(zhǔn)確的分析方法或定量方法。本試驗(yàn)就是利用高效液相色譜技術(shù)，建立了一種對(duì)胡桃醌含量的高效、快速的HPLC 檢測(cè)方法。1 材料與方法1． 1 材料核桃主要由貴州省赫章縣提供。97%胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品( Sigma 公司) 、磷酸、磷酸氫二鈉、無水乙醇、氯仿、氫氧化鈉均為分析純，甲醇為色譜純。Agilent1100 高效液相色譜儀，PHS － 3C 型精密pH 計(jì)( 上海精密科學(xué)儀器有限公司) ，XS － 20B 粉碎機(jī)( 上海兆申電子科技有限公司) ，ALC － 110． 4 電子天平( 北京賽多利科學(xué)儀器有限公司) ，ＲE － 52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( 上海亞榮生化儀器廠) ，H － 1850Ｒ 型高速冷凍離心機(jī)( 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司) ，101 － 2AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱( 天津泰斯特儀器有限公司) ，SC － 316 冰箱( 山東省青島海爾股份有限公司) ，78 － 1型磁力攪拌器( 江蘇省常州澳華儀器有限公司) ，KQ － 50 型超聲波清洗器( 江蘇省昆山市超聲波儀器有限公司) 。1． 2 方法1． 2． 1 色譜條件色譜柱選用C18柱( 4． 6 mm × 150 mm，5 μm) ，流動(dòng)相采用甲醇－ 水( 體積比1 ∶ 1) ，水相先用磷酸調(diào)節(jié)pH 值約為4，流速為0． 8 mL/min，紫外檢測(cè)波長為250 nm，柱溫為30 ℃。1． 2． 2 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精確稱取胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品5． 0 mg，置于25 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解( 在超聲波清洗器上振蕩5 min 后) 在室溫下冷卻后再用甲醇定容，搖勻，即得200 μg /mL 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液須放在冰箱中保存，防止甲醇揮發(fā)和長時(shí)間放置在陽光下使標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)分解，給試驗(yàn)帶來誤差。1． 2． 3 最大吸收波長的測(cè)定和選擇對(duì)胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液在220 ～ 400 nm 的范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，選定檢測(cè)波長。1． 2． 4 流動(dòng)相組成的確定以甲醇－ 水體系作為流動(dòng)相，進(jìn)行等度洗脫。固定流動(dòng)相的流速為0． 8 mL/min。為了選擇最佳的流動(dòng)相配比，改變流動(dòng)相中甲醇的比例，使其體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，測(cè)定胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間和峰面積。1． 2． 5 pH 值的確定常用來調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 值的化合物有磷酸、醋酸、磷酸鹽緩沖溶液和醋酸鹽緩沖溶液。本試驗(yàn)采用磷酸來調(diào)節(jié)pH 值而不采用醋酸的主要原因是磷酸的紫外吸收較小且屬于中等強(qiáng)酸，等量的0． 1%磷酸溶液和1%醋酸溶液的pH 值相等，除此之外，磷酸還不損壞色譜儀器的接口。用磷酸調(diào)節(jié)水相的pH 值分別為2、3、4、5、6、7，加入流動(dòng)相中的有機(jī)相和水相的體積比為1 ∶ 1，測(cè)定不同pH 值下胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間和峰面積。1． 2． 6 柱溫的選擇本試驗(yàn)考察了溫度對(duì)色譜分離的影響，在選定的上述條件下，分別在柱溫為18、22、26、30、34、38、42 ℃ 時(shí)測(cè)定胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間和峰面積。1． 2． 7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用甲醇稀釋200 μg /mL 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備質(zhì)量濃度為10、20、50、100、120、150 μg /mL 系列標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，按照上述確定的色譜條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品系列工作溶液的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)作工作曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。1． 2． 8 精密度試驗(yàn)取質(zhì)量濃度分別10、50、100 μg /mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照已經(jīng)確定的色譜條件，各進(jìn)樣3 次，分別測(cè)定峰面積并計(jì)算胡桃醌濃度、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差( ＲSD) 。1． 2． 9 穩(wěn)定性試驗(yàn)將20 μg /mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液放置在室溫條件下，不做任何避光保護(hù)，每隔2 h 進(jìn)樣測(cè)定1 次，共進(jìn)行5次，分別測(cè)定其峰面積并計(jì)算胡桃醌濃度、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。1． 2． 10 重復(fù)性試驗(yàn)取20 μg /mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液5 份，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，分別測(cè)定峰面積并計(jì)算胡桃醌濃度、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。1． 2． 11 加標(biāo)回收率試驗(yàn)分別取3 份5 mL 50 μg /mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入0． 5、0． 8、1． 0 mL 200 μg /mL 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述進(jìn)樣方法操作，測(cè)定其峰面積，重復(fù)測(cè)定3 次，計(jì)算平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。