摘要：實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為發(fā)酵菌株、菜籽粕為原料，菜籽多肽得率和硫代葡萄糖苷（硫苷）降解率為發(fā)酵菜籽粕品質(zhì)的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及Box-Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)固態(tài)發(fā)酵制備菜籽多肽的工藝進(jìn)行研究，得到最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間為70h，液料比為1.3∶1mL/g，接種量為15%，發(fā)酵溫度為31℃，此時(shí)多肽得率、硫苷降解率可達(dá)15.94%、62.14%，兩者的綜合評(píng)分達(dá)到最高值，與響應(yīng)面理論值吻合性良好。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌，固態(tài)發(fā)酵，多肽，響應(yīng)面分析

油菜籽是中國(guó)最主要的油料資源之一，近年來(lái)其產(chǎn)量在世界上名列前茅[1]。油菜籽榨油之后得到的副產(chǎn)物為菜籽粕，后者富含蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素和維生素，氨基酸組成較平衡，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的植物蛋白資源[2]。但菜籽粕含有硫苷、芥酸、單寧和植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，嚴(yán)重限制了它的應(yīng)用范圍[3-5]。菜籽肽是以菜籽粕或菜籽蛋白為原料通過(guò)降解而得到的一種低分子肽混合物，不但具有一定的營(yíng)養(yǎng)功能，還具有多種生物活性，如抗氧化，降血壓等。目前，以菜籽粕或菜籽蛋白為原料制備菜籽肽的方法主要有酶水解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)水解法。微生物發(fā)酵法可以利用微生物產(chǎn)生的豐富的酶系，將菜籽粕中的大分子蛋白水解成菜籽肽的同時(shí)降解菜籽粕中的有毒物質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)因子[6-10]，因而備受關(guān)注。固態(tài)發(fā)酵與其他培養(yǎng)方式相比具有培養(yǎng)基簡(jiǎn)單且來(lái)源廣、技術(shù)較簡(jiǎn)單、投資少、能源消耗低、后期處理較簡(jiǎn)單、發(fā)酵過(guò)程粗放等優(yōu)點(diǎn)[11-13]。本實(shí)驗(yàn)采用微生物固態(tài)發(fā)酵法同時(shí)生產(chǎn)菜籽肽并降解硫苷，采用響應(yīng)面分析的方法及多指標(biāo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合加權(quán)評(píng)分法優(yōu)化菜籽粕固態(tài)發(fā)酵工藝，兼顧抗?fàn)I養(yǎng)因子的脫除和多肽的得率，以獲得最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件，降低生產(chǎn)成本，縮短發(fā)酵周期，提高菜籽粕品質(zhì)及綜合利用率，為菜籽粕的有效開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菜籽粕w（粗蛋白）≥40.80%，w（水分）≤9.0%，硫苷≥46.51μmol/g，40目過(guò)篩，由丹陽(yáng)市正大油脂有限公司提供；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）W1-3 本實(shí)驗(yàn)室從鎮(zhèn)江恒順醋醅分離得到，北京諾賽基因公司鑒定；Gly-Gly-Tyr-Arg 購(gòu)于SIGMA公司；其他試劑分析純；基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基含蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、牛肉浸膏0.3%、瓊脂2%，pH7.0；種子培養(yǎng)基含蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、牛肉浸膏0.3%，pH為7.0；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基菜籽粕30g，水依據(jù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)不同的設(shè)計(jì)要求加入。BS124S型電子天平賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；YX280A型滅菌鍋上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-1601型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京諾利分析儀器公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TGL-16型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；QYC-200型全溫空氣搖床上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基礎(chǔ)種子與種子液制備將實(shí)驗(yàn)室保存的菌種接種基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，在30℃的生化培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24h，讓菌種活化。挑取活化后的2環(huán)菌體接入100mL滅過(guò)菌的裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，8層紗布封口，放在空氣搖床中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，溫度為30℃，轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)24h。從上述培養(yǎng)好的菌液中按5%的接種量接種到50mL發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h，制成發(fā)酵種子液。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)吸取一定體積上述種子液，接種于裝有滅好菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，用無(wú)菌玻璃棒攪拌混勻，錐形瓶用8層紗布封口，一定溫度下恒溫發(fā)酵一定時(shí)間后，將樣品放入干燥箱中，50℃烘干后，粉碎過(guò)40目篩。

1.2.3 菜籽多肽得率的測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]。取5g粉碎后的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)加入蒸餾水，定容到100mL，攪拌30min，5000r/min離心30min。取上述上清液2mL，加入10%的三氯乙酸水溶液2mL，混勻后靜置10min，再12000r/min離心15min。取2mL上述溶液于玻璃試管中，加入8mL 雙縮脲試劑，混勻后靜置10min，4000r/min離心10min，于540nm下測(cè)定上清液OD值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品多肽濃度，多肽得率按照以

下公式計(jì)算：多肽得率（%）= C×VM ×100式中：C為發(fā)酵液中多肽濃度，mg/mL；V為發(fā)酵液總體積，mL；M為菜籽粕質(zhì)量，mg。

1.2.4 硫苷含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]。硫苷降解率

按照以下公式計(jì)算：硫苷降解率（%）=（原菜籽粕中硫苷含量-發(fā)酵菜籽粕中硫苷含量）/原菜籽粕中硫苷含量×100

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)其他因素條件固定，依次分別以發(fā)酵時(shí)間（36、48、60、72、84、96h），液料比（0.6∶1、0.8∶1、1.0∶1、1.2∶1、1.4∶1、1.6∶1mL/g）、接種量（5%、10%、15%、20%、25%）和發(fā)酵溫度（25、30、35、40℃）為單因素，考察各因素對(duì)多肽得率和硫苷降解率的影響，確定其最佳因素水平。選取前一個(gè)單因素的最優(yōu)水平進(jìn)行后一個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的研究，研究第一個(gè)單因素（發(fā)酵時(shí)間）時(shí)其他因素水平固定為：發(fā)酵溫度30℃、接種量10%、液料比1∶1。

1.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選取對(duì)

發(fā)酵影響較大的發(fā)酵時(shí)間（A）、液料比（B）和發(fā)酵溫度（C）三個(gè)單因素為研究因素，以多肽得率（Y1）、硫苷降解率（Y2）和兩者的綜合評(píng)分（OD）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的中心組合設(shè)計(jì)。因素及其水平如表1所示，-1、0、1分別代表各因素的低、中、高3

個(gè)水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析的軟件為SPSS 16.0；響應(yīng)

面設(shè)計(jì)與分析的軟件為Design-Expert 8.0；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.4.2 綜合評(píng)分（overall desirability，OD） 在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，既需最大限度地對(duì)菜籽粕中的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行降解，又要保證較高的多肽的得率，所以選取多肽得率和硫苷降解率一同作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，并且將兩者權(quán)重系數(shù)均設(shè)為0.5，則：OD＝（D1×0.5＋D2×0.5）。在計(jì)算綜合指標(biāo)之前，采用極差化法將各指標(biāo)進(jìn)行規(guī)格化[16]。由于多肽得率和硫苷降解率均要求達(dá)到最大化，其規(guī)格化方程為：Di=（Yi-Ymin）/

（Ymax-Ymin），其中，Ymax和Ymin分別為各指標(biāo)的最大值與最小值，若某實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)值為Ymax時(shí)，將Di設(shè)為1。反之，某個(gè)指標(biāo)值為Ymin時(shí)，Di為0[17]。