苦菜氨基酸的提取

準(zhǔn)確地稱?。保埃缈嗖朔勰ㄟ^１２０目篩）于１００ｍＬ錐形瓶中，加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，搖勻，用保鮮膜將瓶口密封，在一定的超聲波功率下超聲提取一定時(shí)間后冷卻抽濾，超聲提?。泊危喜纱螢V液．將濾液轉(zhuǎn)至梨形分液漏斗中加入石油醚（Ｖ（石油醚）∶Ｖ（提取液）＝１∶２０）純化脫除脂溶性雜質(zhì)，再轉(zhuǎn)移到１００ｍＬ容量瓶中定容，搖勻，作為供試品溶液備用．

１．２．２　苦菜氨基酸的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)液的配制：將Ｌ－ 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品于１００℃下干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取酪氨酸０．０１０?。埃?，加０．０２ｍｏｌ·Ｌ－１的ＮａＯＨ 溶液１０ｍＬ，溶解完全后轉(zhuǎn)移到１００ｍＬ容量瓶中，用蒸餾水定容后搖勻，得０．１００ｍｇ·ｍＬ－１的Ｌ－ 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用．

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用吸量管準(zhǔn)確吸?。?，１．００，２．００，３．００，４．００，５．００，６．００ｍＬ標(biāo)準(zhǔn)液于２５ｍＬ容量瓶中制成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液．分別加２％茚三酮溶液１．００ｍＬ和ｐＨ＝６．８的磷酸鹽緩沖溶液２．００ｍＬ，搖勻，瓶口用保鮮膜封住于水浴鍋中加熱１５ｍｉｎ，取出，冷卻至室溫，定容．利用７２２Ｓ可見分光光度計(jì)在最大波長(zhǎng)（λｍａｘ＝５６６ｎｍ）處測(cè)定吸光度，以Ｌ－ 酪氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（ｘ）、吸光度為縱坐標(biāo)（ｙ）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖１．?dāng)M合的線性回歸方程為：ｙ＝０．０２１　４ｘ－０．０００?。担遥玻剑埃?

９９９?。福畧D１?。蹋?酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Ｆｉｇ．１?。裕瑁濉。螅簦幔睿洌幔颍洹。悖酰颍觯濉。铮妗。蹋裕颍铮螅椋睿?

１．２．３　樣品中氨基酸提取率的測(cè)定

從供試品溶液中準(zhǔn)確量取５．００ｍＬ的苦菜提取液于２５ｍＬ容量瓶中，按１．２．２中方法顯色后，取出，冷卻，用乙醇定容．用７２２Ｓ可見分光光度計(jì)在λｍａｘ＝５６６ｎｍ處測(cè)定其吸光度，代入回歸方程計(jì)算總氨基酸含量，根據(jù)下式計(jì)算出超聲波提取液中氨基酸的提取率ｗ．

ｗ ＝ρ×１００ｍＬ×２５ｍＬ５ｍＬ×１０６×ｍ ×１００％式中，ｗ 為樣品中總氨基酸的含量（以Ｌ－ 酪氨酸計(jì)），％；ρ為樣品中總氨基酸的質(zhì)量濃度，μｇ·ｍＬ－１；ｍ 為樣品的質(zhì)量，ｇ．

２　結(jié)果與分析

２．１　苦菜提取物的組成表征

標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的預(yù)處理：按文獻(xiàn)方法對(duì)苦菜提取樣進(jìn)行樣品的處理，備用．異硫氰酸苯酯柱前衍生化反應(yīng)：精確量取苦菜樣品溶液１ｍＬ，分別置于５ｍＬ的離心管中，真空干燥；加入１ｍＬ的再干燥液（Ｖ（乙醇）∶Ｖ（水）∶Ｖ（三乙胺）＝２∶２∶１），再加入衍生劑溶液２ｍＬ（Ｖ（異硫氰酸苯酯）∶Ｖ （甲醇）∶Ｖ （三乙胺）∶Ｖ（水）＝１∶７∶１∶１），超聲處理２０ｍｉｎ后放置２０ｍｉｎ，再真空干燥．干燥后的樣品加１０ｍＬ樣品稀釋液，超聲溶解，用０．４５μｍ濾膜過濾，備用（密閉４℃）．色譜條件：色譜柱Ｅｃｌｉｐｓｅ?。兀模拢茫保福ǎ矗叮恚?

×１５０ｍｍ，５μｍ）；流動(dòng)相Ａ 為０．１ｍｏｌ·Ｌ－１乙酸鈉溶液（冰醋酸調(diào)節(jié)ｐＨ＝６．５０）－乙腈（Ｖ（乙酸鈉溶液）∶Ｖ（乙腈）＝９３∶７）；流速１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；檢測(cè)波長(zhǎng)２５４ｎｍ，柱溫３６ ℃，進(jìn)樣量１０μＬ．梯度洗脫：按照表１中流動(dòng)相Ａ、流動(dòng)相Ｂ體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行對(duì)照品和樣品溶液的洗脫，總時(shí)間為２１ｍｉｎ

通過高效液相對(duì)苦菜中所含氨基酸的組分進(jìn)行定性分析，圖２中的出峰保留時(shí)間與文獻(xiàn)［１８］中氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間基本保持一致，根據(jù)

不同氨基酸的極性各不相同判定所得苦菜提取物中的１７種氨基酸，結(jié)果如表２所示．

２．２　單因素實(shí)驗(yàn)

２．２．１　超聲功率對(duì)苦菜氨基酸提取率的影響

固定料液比為１ｇ料４０ｍＬ乙醇（下同），乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為６０％，超聲提取２次，每次３０ｍｉｎ，超聲提取溫度６０℃，考察超聲功率對(duì)苦菜氨基酸提取率的影響，結(jié)果見圖３．在實(shí)驗(yàn)過程中所使用的超聲儀器，其功率可調(diào)范圍（４０～１００Ｗ）較?。蓤D３可知，超聲功率對(duì)苦菜氨基酸的提取率有一定的影響，但并不是功率越大提取率越高，在７０Ｗ 之后提取率呈或高或低波動(dòng)；超聲功率較低時(shí)，機(jī)械振動(dòng)不劇烈、對(duì)細(xì)胞破壞程度小，空化作用不夠，不足以令溶質(zhì)迅速擴(kuò)散，提取率低；功率過高時(shí)，機(jī)械振動(dòng)產(chǎn)生的超聲強(qiáng)烈效應(yīng)可能導(dǎo)致提取液中氨基酸的結(jié)構(gòu)

被破壞．另外，苦菜的細(xì)胞壁也可能變形、破裂，而使內(nèi)含物釋放，使氨基酸提取率假性提高．綜上只要在一定的功率下保證有較高的提取率即可，實(shí)驗(yàn)表明，最佳超聲功率為６０Ｗ．

２．２．２　乙醇質(zhì)量濃度對(duì)苦菜氨基酸提取率的影響

固定料液比為１ｇ料４０ｍＬ乙醇、超聲提?。泊危看危常埃恚椋?，超聲提取溫度６０℃，超聲功率為６０Ｗ，考察乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苦菜氨基酸提取率的影響，結(jié)果見圖４．由圖４可見乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)在６０％時(shí)，苦菜中氨基酸的提取率最高．由于苦菜中的氨基酸成分有１７種之多［９］，根據(jù)相似相溶原理，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于和大于６０％時(shí)提取率低，可能是因?yàn)橘|(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低時(shí)樣品中非極性氨基酸溶出量少，反之，質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高則降低極性氨基酸的溶出．此外，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，會(huì)使脂溶性色素隨之溶解，造成假性的吸光度增加，即提取率假性提高．

２．２．３　料液比對(duì)苦菜氨基酸及提取率的影響

固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為６０％，超聲提取２次，每次３０ｍｉｎ，超聲功率６０Ｗ，超聲提取溫度６０℃考察料液比對(duì)苦菜氨基酸提取率的影響，結(jié)果見圖５．由圖５可知，隨著乙醇的增加，苦菜氨基酸的提取率明顯增加，增至３０ｍＬ后提取率呈緩和趨勢(shì)，所以保持一定的料液比是很有必要的．剛開始提取率較低可能是因?yàn)槿軇┝啃r(shí)，氨基酸沒能完全溶解在溶劑中，隨著乙醇體積的增加，提取得越徹底，但綜合考慮提取率、經(jīng)濟(jì)成本因素以及降低濃縮負(fù)擔(dān)等原因，在實(shí)驗(yàn)過程中選擇１ｇ料加４０ｍＬ乙醇為最佳的料液比．

２．２．４　超聲提取時(shí)間對(duì)苦菜氨基酸提取率的影響

固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為６０％，超聲提?。泊危弦罕葹椋保缌希矗埃恚桃掖?，超聲功率６０Ｗ，超聲提取溫度６０℃，考察超聲提取時(shí)間對(duì)苦菜氨基酸提取率的影響，結(jié)果見圖６．由圖６可知，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)苦菜氨基酸的提取率先增大后減小，當(dāng)提取時(shí)間為３０ｍｉｎ時(shí)達(dá)到最大，而后氨基酸的提取量減少；可能的原因是，在加熱的條件下，時(shí)間越長(zhǎng)，乙醇的揮發(fā)量越多，乙醇質(zhì)量濃度下降，同時(shí)氨基酸被氧化分解的量也增加，從而造成提取率降低，因此確定３０ｍｉｎ為最佳超聲提取時(shí)間．圖６　超聲提取時(shí)間對(duì)苦菜氨基酸提取率的影響

Ｆｉｇ．６?。裕瑁濉。澹妫妫澹悖簟。铮妗。澹簦颍幔悖簦椋铮睢。簦椋恚濉。妫颍幔悖簦椋铮睢。铮睿澹簦颍幔悖簦椋铮睢。颍幔簦濉。铮妗。簦铮簦幔臁。幔恚椋睿铩。幔悖椋洌?

２．２．５　超聲提取溫度對(duì)苦菜氨基酸提取率的影響

固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為６０％，超聲提取２次，每次３０ｍｉｎ，１ｇ料４０ｍＬ乙醇，超聲功率６０Ｗ，考察超聲提取溫度對(duì)苦菜氨基酸提取率的影響，結(jié)果見圖７．圖７　超聲提取溫度對(duì)苦菜氨基酸提取率的影響Ｆｉｇ．７?。裕瑁濉。澹妫妫澹悖簟。铮妗。澹簦颍幔悖簦椋铮睢。簦澹恚穑澹颍幔簦酰颍澹妫颍幔悖簦椋铮睿铮睢。澹簦颍幔悖簦椋铮睢。颍幔簦濉。铮妗。簦铮簦幔臁。幔恚椋睿铩。幔悖椋洌笥蓤D７可知，苦菜氨基酸的提取率隨提取溫度的升高先增大后減少，當(dāng)提取溫度為６０℃時(shí)達(dá)到最大值；溫度升高，擴(kuò)散系數(shù)增大，提取劑的滲透能力也相應(yīng)地增加，使有效成分浸出速率增大；但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，提取率反而降低，可能是由于氨基酸化合物在較高溫度下會(huì)發(fā)生氧化分解等反應(yīng)而遭到破壞；此外，過高的溫度會(huì)加速乙醇的揮發(fā)速度，使溶劑乙醇的濃度迅速降低而影響了氨基酸的溶出．

２．３　正交實(shí)驗(yàn)［２０］

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)苦菜中氨基酸的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，選用Ｌ９（３４）正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，選擇提取時(shí)間（Ａ）、乙醇質(zhì)量濃度（Ｂ）、料液比（Ｃ）、提取溫度（Ｄ）４個(gè)因素，每個(gè)因素選擇３個(gè)水平，確立因素水平表３，提取結(jié)果見表３．由表４可知，各因素對(duì)超聲波提取苦菜氨基酸提取率的影響大小依次為：Ｂ＞Ｃ＞Ａ＞Ｄ，即乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞料液比（１ｇ料加的乙醇量）＞提取時(shí)間＞提取溫度．確定最佳提取工藝條件為：Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ２，即超聲提取時(shí)間為３０ｍｉｎ，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為６０％，料液比為１ｇ料４０ｍＬ乙醇，超聲提取溫度為６０℃．

２．４　最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ２工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表５．在Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ２工藝條件下，三明野生苦菜氨基酸得率的平均值為１．２９％，相比于正交實(shí)驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的４號(hào)瓶提高了０．１０％，進(jìn)一步確定了Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ２為三明野生苦菜中氨基酸超聲波提取的最佳工藝條件．

３　結(jié)　　論

（１）超聲波法提取苦菜中氨基酸的最佳提取工藝條件為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)６０％，超聲功率６０Ｗ，料液比為１ｇ料４０ｍＬ 乙醇，提取時(shí)間３０ｍｉｎ，提取溫度６０ ℃，此時(shí)氨基酸的提取率１．２９％．

（２）本文對(duì)苦菜提取液進(jìn)行ＰＩＴＣ柱前衍生反應(yīng)，使總氨基酸發(fā)生解離，利用高效液相色譜法對(duì)苦菜中所含的氨基酸進(jìn)行定性分析，每一種氨

基酸都可正常出峰，１７種氨基酸被檢出，其中有７種人體必需氨基酸．

（３）異硫氰酸苯酯柱前衍生－高效液相色譜法與相關(guān)文獻(xiàn)的測(cè)定方法相比，該法不需要對(duì)胱氨酸另外處理，分析速度快、時(shí)間短，靈敏度、精密

度、分離度高，檢出限低，選擇性好，通用性強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便．

（４）正交實(shí)驗(yàn)超聲波提取苦菜中氨基酸影響因素的重要性依次為：乙醇質(zhì)量濃度＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度．