氯羥吡啶又名克球酚，是一種廣譜抗球蟲增效劑，氯羥吡啶在環(huán)境中降解緩慢，可誘發(fā)人的心臟冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張和血流量增加，對(duì)于存在冠狀動(dòng)脈疾患的人群是非常危險(xiǎn)的。氯羥吡啶具有一定的致畸性和胚胎毒作用[2]。我國(guó)政府規(guī)定了氯羥吡啶在雞肉中的殘留限量為5 000 μg/kg，在牛奶中的殘留限量為20 μg/kg。

  關(guān)于氯羥吡啶殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC），氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC /MS），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS /MS）及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB29700-2013等，而有關(guān)牛奶中氯羥吡啶殘留檢測(cè)較少。本研究建立了一種簡(jiǎn)單、靈敏、可靠地檢測(cè)牛奶中氯羥吡啶殘留量的高效液相色譜定量分析方法。

實(shí)驗(yàn)

材料與試劑

  氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)品（含氯羥吡啶（C7H7C12NO）99.7%），甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），磷酸二氫鉀（分析純），磷酸氫二鈉（分析純），堿性氧化鋁柱。磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）：準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4）2.09 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.40 g，加水溶解并稀釋至500 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.0。氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取氯羥吡啶約25 mg，置250 mL容量瓶中加甲醇溶解，并稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱中保存，臨用前，準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇稀釋成濃度為適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

儀器與設(shè)備

  戴安高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器），漩渦混合器，離心機(jī)，分析天平（感量0.0001 g），氮吹儀。

實(shí)驗(yàn)條件

  色譜柱為反相C18 柱250 mm× 4.6 mm，粒徑5 μm；流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）：乙腈（85：15）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；進(jìn)樣量20 μL；理論塔板數(shù)按氯羥吡啶峰計(jì)算，應(yīng)不低于1 500（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)理論塔板數(shù)在18 000 左右）；色譜測(cè)定取適量試樣溶液和相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液做單點(diǎn)校準(zhǔn)，以色譜峰面積積分值定量。

方法

提取

  準(zhǔn)確稱取5 g±0.05 g 試樣，置于50 mL離心管中，加入1.0 g 左右氯化鈉，2.5 g 左右硫酸鎂，用25 mL乙腈分3 次各漩渦2 min，8000 r/min 離心5 min，分離并合并上清液備用。

凈化

  將堿性氧化鋁柱分別用10 mL甲醇、乙腈依次潤(rùn)洗，加入提取的上清液，過柱，收集流出液用氮吹儀吹干，濃縮液用1 mL 50%甲醇溶解漩渦1 min，用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾兩次上機(jī)測(cè)定。

方法驗(yàn)證

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作及檢出限

  在上述檢測(cè)條件下，以50% 甲醇溶液為空白對(duì)照，利用氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為100 μg/mL）配制系列稀釋氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，5.0，10.0，20.0，100.0，200.0，300.0 μg/kg），測(cè)定其對(duì)應(yīng)的

吸光度，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到氯羥吡啶的線性方程和相關(guān)系數(shù)，并對(duì)空白樣品進(jìn)行20次的重復(fù)測(cè)定。

方法回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

  采用對(duì)陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)來考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，即對(duì)本底不含氯羥吡啶的陰性牛奶樣品，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)相當(dāng)于20，30，100，200，300 μg/kg 水平的氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率，同時(shí)對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100，200，300 μg/kg加標(biāo)樣品進(jìn)行平行樣測(cè)定計(jì)算其精密度。

結(jié)果與分析

提取條件的選擇

  直接使用乙腈對(duì)牛奶中氯羥吡啶殘留的提取試驗(yàn)，結(jié)果表明，第一次離心后沉淀物變?yōu)槟z狀物質(zhì)，第二次提取時(shí)無法混勻，回收率低；采用在樣品中增加一定量的氯化鈉和硫酸鎂可以避免此現(xiàn)象發(fā)生，溶劑，回收率都比較理想。因此，研究加入乙腈后再加入一定量的氯化鈉和硫酸鎂作為提取溶劑來提取牛奶中氯羥吡啶。

凈化條件的選擇

  對(duì)同一個(gè)加標(biāo)濃度提取的上清液，其中一個(gè)過使用堿性氧化鋁柱凈化后氮吹定容上機(jī)測(cè)定，另外一個(gè)不使用氧化鋁柱凈化直接氮吹定容上機(jī)，回收率分別為87.78%、91.71%，回收率結(jié)果無明顯差異，但是后者定容后雜質(zhì)較多，影響色譜柱的使用壽命，所以建議使用堿性氧化鋁柱進(jìn)行過濾凈化。

結(jié)論

  本文研究了高效液相色譜法檢測(cè)牛奶中氯羥吡啶的方法，通過對(duì)提取條件和凈化條件的優(yōu)化，建立了合理、可靠的測(cè)定牛奶中氯羥吡啶的高效液相分析方法。在確定的條件下，氯羥吡啶響應(yīng)較好，定性檢出限為5 μg/kg，定量檢出限為15 μg/kg。對(duì)牛奶進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為87.34%到93.52%之間，重復(fù)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.67%～6.71%。