目的：優(yōu)化蠶蛹多糖的提取工藝及對蠶蛹多糖的脫色條件的研究。方法：采用正交實驗方法，以蠶蛹多糖的得率為指標，優(yōu)化微波法對蠶蛹多糖的提取工藝。研究離子交換樹脂（D202、D113）和大孔吸附樹脂（HZ-841、HZ-806、HZ-803）對蠶蛹多糖的脫色效果。通過正交實驗確定蠶蛹多糖脫色的最佳條件。結果：傳統工藝提取最佳條件：90℃提取3.5h，固液比1∶25g/mL，蠶蛹多糖的得率為3.95%；微波提取蠶蛹多糖的最佳工藝條件：微波功率600W，提取時間9min，固液比1∶25g/mL，蠶蛹多糖的得率為4.49%。蠶蛹多糖大孔樹脂脫色的最佳條件為HZ-803樹脂、pH4.0、溫度45℃。結論：優(yōu)化之后的微波提取法提取蠶蛹多糖的得率有顯著的提高，且工藝簡便、合理、可行，在大孔樹脂靜態(tài)吸附最佳脫色的條件下脫色率、多糖保留率和蛋白質去除率分別為88.56%、62.15%、92.21%，在大孔樹脂動態(tài)吸附最佳脫色的條件下脫色率、多糖保留率和蛋白質去除率分別為89.43%、65.58%、90.56%。

關鍵詞：蠶蛹多糖，微波法，正交實驗，脫色

蠶蛹（silkworm.faeces）別名小蜂兒，為蠶蛾科動物家蠶蛾的蛹，其表面棕黃色至棕褐色，有不規(guī)則皺紋，具有殺蟲療疳，生津止渴等功能[1]，蠶蛹中多糖是由10個以上的單糖通過糖苷鍵鏈接而成的聚糖，其具有抗腫瘤、抗病毒、增強機體免疫力和抗衰老等生物方面的活性[2-4]。研究表明，與傳統的堿液提取多糖相比，微波提取多糖具有加熱均勻，溶劑用量少，耗時少，選擇性強，污染小，提取率高，且與傳統技術相比，有利于提取中藥中熱不穩(wěn)定的活性物質[5]，本實驗將微波法應用于蠶蛹多糖的提取，并與傳統的堿液提取法進行比較和研究，優(yōu)化蠶蛹多糖的提取工

藝，但初提出來的蠶蛹多糖含量較低，而且呈現棕黃色，會影響到進一步的分離純化和作用原理等方面的研究，筆者通過不同樹脂對蠶蛹多糖脫色進行了研究，并通過正交實驗對脫色效果進行了優(yōu)化，以期為蠶蛹多糖的進一步研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶蛹實體購置于遼寧省錦州市；無水葡萄糖北京化工廠生產；95%乙醇、無水乙醇、正丁醇、氯仿天津市天力化學試劑有限公司；正丁醇深圳市明卓化工有限公司；氫氧化鈉天津市順興工貿有限公司；石油醚淄博市臨淄東方紅化工廠生產；三氯甲烷、考馬斯亮藍G250 天津市光復精細化工研究所；牛血清蛋白上海藍技科技發(fā)展有限公司；重蒸酚北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；離子交換樹脂（D202、D113）、大孔吸附樹脂（HZ-841、HZ-806、HZ-803） 河北華眾化工有限公司。500g搖擺式中藥粉碎機溫嶺市奧力中藥機械有限公司；DHG-9075A型恒溫鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋金壇市科析儀器有限公司；P202N型電子天平上海精密科學儀器有限公司；Galanz WD900B型微波爐順德市格蘭仕電器實業(yè)有限公司；SKQ-2200型超聲波清洗器上海生析超聲儀器有限公司；SHZ-3型循環(huán)水真空泵、RE5298A型旋轉蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；LD4-1.8型臺式自動平衡離心機北京京立離心機有限公司；UV2550型紫外可見分光光度儀日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蠶蛹多糖的提取比較樣品的預處理：將蠶蛹在60℃烘箱中烘干，用粉碎機將其粉碎，過60目篩，取蠶蛹粉末適量，按照原料∶石油醚=1∶3（W∶V）加入石油醚浸泡，放置12h脫脂，過濾，濾渣重復再進行浸提兩次，濾渣在室溫下晾干[6]。

1.2.1.1 傳統工藝稱取經預處理的蠶蛹粉末適量，按一定的體積比加入0.02mol/L的堿液（根據孫龍[6]對蠶蛹多糖堿液的提取研究確定堿液的最佳提取濃度是0.02mol/L），在恒溫水浴中加熱，提取2次，合并兩次濾液，用鹽酸調節(jié)濾液的pH至7.0左右，用旋轉蒸發(fā)儀在60℃真空下濃縮濾液至適當的體積，向濃縮液中加入Sevag試劑（三氯甲烷-正丁醇=5∶1）除去蛋白，在4℃，2000r·min-1離心15min，取上清液。重復幾次，直到無蛋白層出現，完全脫去蛋白質為止。向多糖溶液中加入4倍體積95%的乙醇沉淀，放置在4℃環(huán)境下過夜，2000r·min-1離心，將沉淀用無水乙醇進行洗滌兩次，沉淀于60℃恒溫下進行干燥，計算多糖的得率。傳統工藝法提取蠶蛹多糖與提取溫度、提取時間、料液比三個因數有關，本實驗進行L9 （ 33）正交實驗后，計算多糖的得率，正交因素水平表如表1所示。

1.2.1.2 微波提取稱取經過預處理的蠶蛹粉末適量，按一定的體積比加入0.02mol/L的堿液，在一定的微波功率下進行多糖的提取，提取2次，合并兩次濾液（后續(xù)方法同1.2.1.1）。微波提取法提取蠶蛹多糖與微波功率、微波時間、料液比三個因數有關，本實驗進行L9 （ 33）正交實驗后，計算多糖的得率，正交因素水平表如表2。

1.2.1.3 多糖得率的計算蠶蛹多糖得率（%）=粗多糖質量/蠶蛹粉末質量×100

1.2.2 蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法[7]，制作蛋白標準曲線。以蛋白濃度C為橫坐標，以吸光度A為縱坐標得回歸方程A=0.0068C-0.0184，r=0.9997，結果表明蛋白質在20～90μg/mL范圍內質量濃度與吸光度呈線性相關，如圖1所示。

1.2.3 多糖含量的測定采用苯酚—硫酸的方法測定蠶蛹多糖的含量[8]，精確稱取于105℃烘干至恒重的葡萄糖0.0100g，置100mL的容量瓶中，加入蒸餾水溶解，稀釋至容量瓶的刻度，用移液管吸取該溶液10mL置于100mL容量瓶中，稀釋至刻度，配制成標準溶液待用。分別量取配制的標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL置于10mL的試管中，依次添加蒸餾水至體積1.0mL，空白對照組為蒸餾水1.0mL向每

個試管中各加入5%的苯酚溶液1.0mL，搖勻，分別向每個試管中加入5mL濃硫酸，放置30min，冷卻至室溫，用紫外分光光度計于490nm波長處分別測吸光度，得線性回歸方程y=0.4604x-0.0014，相關系數R2=0.9995，結果表明葡萄糖在1～9μg/mL范圍內質量濃度與吸光度呈線性相關，如圖2所示。

1.2.4 蠶蛹多糖脫色

1.2.4.1 樹脂的預處理[9] 陽離子交換樹脂：用去離子水浸泡24h→5%HCl浸泡3h，并不時攪拌→用去離子水洗滌至中性→5%NaOH浸泡3h→用去離子水洗滌至中性→5%HCl浸泡3h→去離子水洗滌至中性備用。陰離子交換樹脂：用去離子水浸泡24h→5% NaOH浸泡3h，并不時攪拌→用去離子水洗滌至中性→5% HCl浸泡3h→用去離子水洗滌至中性→5% NaOH浸泡3h→去離子水洗滌至中性備用。吸附樹脂：5% HCl浸泡3h→用去離子水洗滌至中性→5% NaOH浸泡3h→用去離子水洗滌至中性→用95%的乙醇浸泡24h→用去離子水洗至無醇味。

1.2.4.2 脫色靜態(tài)吸附實驗：采用靜態(tài)吸附法測定不同樹脂對蠶蛹多糖溶液的脫色能力。取一定量處理好的離子交換樹脂或吸附樹脂，加入100mL的三角瓶中，向三角瓶中加入25mL 1%的蠶蛹多糖溶液，在恒溫條件下振蕩2.5h（120r/min），靜置24h，用濾紙過濾，測定不同樹脂的脫色率，蠶蛹多糖保留率和蛋白質的去除率。

1.2.4.3 靜態(tài)吸附正交實驗樹脂作用于多糖脫色時與樹脂的類型、溶液的pH、溫度三個因數有關。本實驗進行L9 （ 33）實驗后，分別測定不同樹脂的脫色率，蠶蛹多糖保留率和蛋白質的去除率，正交因素水平表如表3。

1.2.4.4 動態(tài)吸附實驗根據靜態(tài)吸附實驗的結果，選取HZ-803樹脂做為動態(tài)實驗的樹脂，將預處理后的樹脂以濕法裝柱的方法裝入層析柱中，將20mL蠶蛹多糖以一定流速通過層析柱，進行動態(tài)脫色實驗。收集洗脫液定容至200mL，分別計算多糖的脫色率、多糖保留率和蛋白質去除率。分別考察上柱液流速、pH和溫度對洗脫效果的影響，得出蠶蛹多糖適宜的脫色條件。

1.2.4.5 蛋白質去除率的計算蛋白脫除率（%）=（C前－C后）/C前×100式中：C前，C后分別是蠶蛹多糖溶液在樹脂處理前、后的蛋白質濃度。

1.2.4.6 脫色率測定對蠶蛹多糖溶液進行了可見光400～600nm掃描，并無發(fā)現最大吸收峰，而且從400~600nm吸收逐漸呈遞減的趨勢，由于蠶蛹多糖溶液在脫色前為棕黃色，根據互補色原理考慮，選擇藍光中間波長段450nm作為檢測波長。脫色率（%）=（A1-A2）/A1×100式中：A1、A2分別為蠶蛹多糖脫色處理前后在450nm的吸光度。

1.2.4.7 多糖保留率的計算在波長490nm分別處測定蠶蛹多糖溶液的吸光度。多糖保留率（%）=（B1-B2）/B1×100式中：B1、B2分別為蠶蛹多糖脫色處理前后在490nm處的吸光度。