本文通過正交試驗，首先優(yōu)化雙歧桿菌和乳酸桿菌混合發(fā)酵工藝，確定得出其最適發(fā)酵條件為：初始pH 值為7.2，培養(yǎng)溫度為35℃，最佳培養(yǎng)基配方為酵母膏0.9%，胰蛋白胨0.6%，大豆蛋白胨0.3%,葡萄糖2.5%，雙歧因子（低聚果糖）0.3%，生長因子5%。在此基礎(chǔ)上，在100L 發(fā)酵罐規(guī)模，進行了乳酸菌和雙歧桿菌通過上述條件混合發(fā)酵中實驗試，實驗結(jié)果顯示，發(fā)酵液中雙歧桿菌、乳酸桿菌發(fā)酵液的活菌數(shù)均達到每mL 在10 億/mL 個以上，可以滿足產(chǎn)業(yè)化需要。

關(guān)鍵詞：雙歧桿菌；乳酸桿菌；混合發(fā)酵

畜用益生菌制劑在改善動物體內(nèi)微生態(tài)平衡、預(yù)防疾病、促進生長及凈化養(yǎng)殖環(huán)境等方面發(fā)揮著重要作用［1-2］。常見的畜用益生菌包括雙歧桿菌、乳酸桿菌等。雙歧桿菌是嚴(yán)格厭氧菌，乳酸桿菌屬于兼性厭氧菌［3］。根據(jù)兩種菌株生長特性的研究結(jié)果，考慮到每個菌種采用不同的發(fā)酵工藝勢必增加工序和成本，且兩種益生菌將混合使用，所以采用雙歧桿菌、乳酸桿菌的混合厭氧發(fā)酵的方案節(jié)省生產(chǎn)成本。將分離到的益生菌進行多次三角搖瓶規(guī)模試驗， 獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件后， 利用10L 發(fā)酵罐100L 發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)工藝條件的優(yōu)化試驗，期望獲得適宜于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)畜用益生菌的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。

1.1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

雙歧桿菌、乳酸桿菌菌種：本實驗分離的菌株由廣州市微生物研究所菌種庫提供。

1.1.2 試劑

所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

電子天平，海第二天平儀器廠；pHS-25 數(shù)顯酸度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；立式電蒸汽滅菌器， 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；754 紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；旋轉(zhuǎn)搖床，上海精密科學(xué)儀器有限公司；10L、100L 發(fā)酵罐等， 上海高機生物工程有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基的配方

1.1.4.1 雙歧桿菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（TPY）TPY 培養(yǎng)基，1L 培養(yǎng)基中含有：酪蛋白胨10g，大豆蛋白胨5g，酵母粉2.5g，葡萄糖5g， 吐溫80 1mL，K2HPO4 2g，MgCl2·6H2O 0.5g，CaCl2 0.15g，ZnSO4·7H2O 0.25g，F(xiàn)eCl3 0.1g， 半胱氨酸鹽酸0.5g，調(diào)pH 至6.5，121℃滅菌15min。

1.1.4.2 雙歧桿菌PTYG 培養(yǎng)基

胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母浸膏10g，葡萄糖10g，半胱氨酸鹽酸鹽1g，吐溫80 1mL，鹽溶液40ml，蒸餾水1000mL。調(diào)pH 6.8-7.0，121℃ 20min滅菌后加硫酸新霉素30-200μg/mL。

上述鹽溶液制備方法如下：

K2HPO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.48g，KH2PO4 1.0g，無水CaCl2 0.2g，NaCl 2.0g，NaHCO3 10.0g， 蒸餾水1000mL?；旌螩aCl2 和MgSO4·7H2O 在300mL 蒸餾水中直至溶解，加500mL 水，一邊攪拌一邊緩慢加入其它鹽類，繼續(xù)攪拌至溶解，加入200mL 蒸餾水，混合

后貯存在4℃?zhèn)溆谩?

1.2 實驗方法

雙歧桿菌和乳酸桿菌活菌數(shù)測定方法如下：雙歧桿菌活菌數(shù)的測定：按GB/T 4789.34-2003測定。乳酸桿菌活菌數(shù)的測定：按GB/T 4789.15-2003測定。雙歧桿菌發(fā)酵條件較乳酸桿菌嚴(yán)格， 所以厭氧發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件以雙歧桿菌的最佳發(fā)酵條件為準(zhǔn)［4-5］。通過多次三角搖瓶規(guī)模試驗探索確定雙歧桿菌的最適發(fā)酵條件。再在此基礎(chǔ)上利用100L 發(fā)酵罐擴大雙歧桿菌和乳酸桿菌混合培養(yǎng)， 進行發(fā)酵培養(yǎng)工藝條件的優(yōu)化試驗， 獲得了適宜于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)畜用益生菌的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。

1.2.1 測定雙歧桿菌生長曲線

將一定量雙歧桿菌接種于恒定體積的液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)，在其生長過程中定時取樣計算細(xì)菌數(shù)，以菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，生長時間為橫坐標(biāo)繪成曲線［6］。根據(jù)細(xì)菌生長曲線粗分為延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4 個階段。但活菌難以計數(shù)，而菌液吸光度值與含菌量成正比，通過OD 值的變化可得知發(fā)酵液中含菌量的變化， 從而可以了解菌體的生長情況， 故實驗中采用測OD 值的方法繪制生長曲線。

1.2.2 測定雙歧桿菌最適初始pH 值

雙歧桿菌在不同pH 值條件下培養(yǎng)， 根據(jù)OD值了解菌體的生長情況。將PTYG 改良液體培養(yǎng)基經(jīng)過濾， 初始pH 值由7.0 分別調(diào)為6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4， 每個pH 值兩支試管做平行對照，每支10ml。滅菌后接5％菌種入培養(yǎng)基，另留同樣體積相同培養(yǎng)基作對照，37℃厭氧培養(yǎng)24h，測定菌液的OD 值。

1.2.3 測定雙歧桿菌最適溫度

溫度是影響微生物生長的最重要因素之一［32］。在最適發(fā)酵溫度下，可以達到最大的發(fā)酵生產(chǎn)水平。將PTYG 改良液體培養(yǎng)基過濾， 分裝（每支試管10mL），115℃，20min 滅菌后接入待測菌種， 將培養(yǎng)溫度由37.5℃改為28℃，30℃，35℃，37℃，40℃，每個溫度做平行對照，培養(yǎng)24h 測定菌液的OD 值。

1.2.4 雙歧桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化方案

根據(jù)顯著因素來確定雙歧桿菌發(fā)酵的水平，酵母膏量固定為0.9%。采用正交實驗法優(yōu)化雙歧桿菌培養(yǎng)基，確定氮源、碳源、雙歧因子和生長因子為試驗因素,設(shè)計L9（34）正交試驗［33］，以獲取培養(yǎng)基的最佳組成。其中培養(yǎng)基備選材料是以PTYG 培養(yǎng)基的組成為依據(jù)。