SSRs(Simple Sequence Repeat)即簡單序列重復(fù), 亦稱微衛(wèi)星DNA (Microsatellite DNA)是近年來發(fā)展起來的建立在PCR(Polymerase Chain Reaction)基礎(chǔ)之上的新型遺傳標(biāo)記。研究發(fā)現(xiàn), SSRs 極豐富地分布在植物基因組中, 并具有很高的多態(tài)性, 如水稻、大豆、玉米、油菜、小麥、大麥等?，F(xiàn)在SSR 標(biāo)記已被廣泛用于基因定位, 種群進(jìn)化及遺傳多樣性研究。研究表明SSR 位點(diǎn)的等位基因數(shù)目比其他類型標(biāo)記揭示的等位基因數(shù)目多, 同時(shí)因其使用程序簡單、快速、重復(fù)性好, 被認(rèn)為是一種理想的遺傳標(biāo)記。在研究中發(fā)現(xiàn), SS R 位點(diǎn)的等位基因數(shù)目除與供試材料數(shù)目、種類以及所用引物有關(guān)外, 與凝膠電泳檢測(cè)系統(tǒng)的關(guān)系也很密切。本文以14 個(gè)玉米自交系為材料比較3 %Metaphor 瓊脂糖凝膠和12 %聚丙烯酰胺凝膠對(duì)35 個(gè)SSR 引物擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性水平的影響, 探討不同凝膠檢測(cè)系統(tǒng)在玉米遺傳變異研究中的應(yīng)用。

1 　材料和方法

1.1 　試驗(yàn)材料

供試的14 個(gè)玉米自交系及其來源見表1 , 其中多數(shù)自交系為我國玉米生產(chǎn)上推廣雜交種的親本。

1.2 　SSR 引物

試驗(yàn)所使用的35 個(gè)引物取自bngl/phi 引物盒(Research Genetics ,Hunt sville)。

1.3 　DNA 提取

采用Sag hai-Maroof 等提出的C TAB 法提取DNA 。用Beckman DU-65型分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度和質(zhì)量, 把DNA 濃度統(tǒng)一調(diào)至10 ng/μL , 備用。

1.4 　擴(kuò)增反應(yīng)

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-225 PCR 儀(MJ Research , Watertown , MA)上進(jìn)行。每20 μL 反應(yīng)體積中含有10 mmol/LT ris-HCl , 50 mmol/L KCl , 0.001 %Gelatin ,1 單位TaqDNA 聚合酶, 2.5 mmol/LMgCl2 , 0.16 mmol/L -4dN TP , 10 %甘油, 0.6 μmol/L SSR 引物對(duì), 50 ng DNA模板。反應(yīng)液上加蓋28 μL 礦物油(SigSigma),以防止反應(yīng)過程中水分蒸發(fā)。

熱循環(huán)反應(yīng)過程包括:93 ℃模板DNA 預(yù)變性1 min , 1 個(gè)循環(huán);93 ℃模板DNA 變性1min , 60 ℃引物與模板靶位點(diǎn)結(jié)合2 min , 70 ℃引物沿模板延伸2 min , 共30 個(gè)循環(huán);最后在72 ℃延伸5 min 。

1.5 　Metaphor (3 %)凝膠電泳檢測(cè)

在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入5 μL 溴酚藍(lán)指示劑, 上樣20 μL , 在3 %濃度的Metaphor 瓊脂糖(FMC Rockland ,ME)凝膠上分離。以ΥΦ174/Hae Ⅲ片段為分子量標(biāo)準(zhǔn), 在100 V 恒壓下電泳3 h , 用溴化乙錠(0.15 μg/mL)染色。在紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果, 用保利來(Polarid)665 型相紙一次成像。

1.6 　聚丙烯酰胺凝膠(12 %)電泳檢測(cè)

采用JIRCAS ATTA 型電泳裝置(日本制造, 規(guī)格16cm ×20 cm ×0.1 cm), 雙面電泳。配制12 %聚丙烯酰胺凝膠40 mL :12 mL 40 % Polyacrylamide (acrylamide∶bisacrylamide =19∶1), 4 mL 1 ×TBE , 24 mL ddH2O , 20 μL TEMED , 160 μL25 %APS (Ammonium persulfate25 %w/v)。在加入TEMED 和APS 后, 立即倒膠, 約30 min 后, 膠凝固。固定玻璃板,倒入1 000 mL 1 ×TBE 緩沖液(內(nèi)、外槽各500 mL)。在250 V 電壓下, 電泳2 h 。然后凝膠依次在10 %冰乙酸中浸泡30 min , 水洗3 次(每次10 min), 0.1 %AgNO3(加入100 μL 38 %Formaldehye)中浸泡30 min , 快速用水沖洗2 次, 然后在2.5 %Na2CO3 (加入50 μL 2.5 %Na2S2O3 , 50 μL 38 %Formaldehye)中顯影至帶型可以區(qū)分為止。用10 %冰乙酸終止顯影。在白熾燈下觀察電泳結(jié)果, 用保利來(Polarid)665 型相紙一次成像。

1.7 　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物以0 , 1 , 9 統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫。在相同遷移率位置上, 有帶記為1 , 無帶記為0 , 缺失數(shù)據(jù)記為9 。以簡單配對(duì)參數(shù)(Simple matching coef ficient)估計(jì)基因頻率, 采用N TS YS-pc version-1.8 (Rohlf 1992)統(tǒng)計(jì)軟件, 依據(jù)GS =m/(m +n)計(jì)算供試自交系之間的遺傳相似系數(shù), 其中m 為基因型間共有帶數(shù)目, n 為差異帶數(shù)目每一個(gè)SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性信息量(Polymorphic Information Co ntent 簡稱PIC)按Senio r MS 等提供的公式計(jì)算, 即PIC =1 -Σf2i, 其中f i 為i 位點(diǎn)的基因頻率。

2 　結(jié)果與分析

2.1 　兩種凝膠電泳系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的比較

采用來自bng l/phi 引物盒的45 個(gè)SSR 引物對(duì)14 個(gè)玉米自交系進(jìn)行同源位點(diǎn)擴(kuò)增, 其中有30 個(gè)引物(見表2)的擴(kuò)增產(chǎn)物在3 % Metaphor 凝膠上具有多態(tài)性, 帶型穩(wěn)定;5 個(gè)引物擴(kuò)增產(chǎn)物帶型呈單態(tài)性;10 個(gè)引物不能有效地啟動(dòng)基因組DNA 或擴(kuò)增質(zhì)量差。選用在3 %Metaphor 凝膠上帶型穩(wěn)定的35 個(gè)引物, 其擴(kuò)增產(chǎn)物在12 %聚丙烯酰胺凝膠上重新檢測(cè), 結(jié)果35 個(gè)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物帶型都呈多態(tài)性。

能有效地?cái)U(kuò)增14 個(gè)玉米自交系DNA 的35 個(gè)引物分布于玉米10 條染色體上。用3 %Metaphor 凝膠檢測(cè)時(shí), 共揭示出86 個(gè)等位基因, 每個(gè)位點(diǎn)1 ～ 4 個(gè), 平均為2.46 個(gè);平均多態(tài)性信息量(PIC)為0.419 , 變化范圍為0 ～ 0.745 。在12 %聚丙烯酰胺凝膠上, 共檢測(cè)出108 個(gè)等位基因, 每個(gè)位點(diǎn)2 ～ 5 個(gè), 平均為3.09 個(gè);平均多態(tài)性信息量(PIC)為0.492 , 變化幅度為0.132 ～ 0.781 。比較分析表明, 在12 %聚丙烯酰胺上檢測(cè)到的等位基因數(shù)和多態(tài)性信息量都顯著多于在3 %Metaphor 瓊脂糖凝膠上檢測(cè)的結(jié)果。這說明聚丙烯酰胺凝膠區(qū)分差異微小片段的能力顯著高于3 %Metaphor 瓊脂糖凝膠。

從表2 可以看出兩種凝膠電泳系統(tǒng)下, 前10 位具有較大PIC 值的SS R 引物所揭示的遺傳多態(tài)性信息量分別占總變異的44.4 %和41.7 %, 擴(kuò)增的等位基因數(shù)占總等位基因數(shù)的40.7 %和40.8 %。這說明不同的SSR 引物在14 個(gè)自交系之間揭示的基因變異存在明顯差異。在10 個(gè)引物中bngl161 , bngl162 , phi001 , bngl125 , phi126 , bngl155 , phi083 及phi053 八個(gè)引物在兩種凝膠系統(tǒng)下均檢測(cè)出高等位基因數(shù)和PIC 值。

2.2 　遺傳變異比較分析

分別利用86 和108 個(gè)多態(tài)性SSR 標(biāo)記計(jì)算14 個(gè)玉米自交系之間的遺傳相似系數(shù)(GS)(表3)。在3 %Metaphor 凝膠電泳下, 玉米自交系之間GS 范圍為0.537 ～ 0.842 , 平均為0.654 。K12 和中自451 的GS (0.537)最小, 而CA156 和掖478 之間的GS (0.842)最大。在12 %聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)得到玉米自交系之間GS 范圍為0.456 ～ 0.814 , 平均為0.602 。K12 和中自451 的GS (0.456)依然最小, 表明兩系間遺傳差異較大;8112 和B73 之間具有最大GS (0.814);CA156 和掖478 的GS(0.740)僅次于8112 和B73 , 居第2 位。兩種電泳系統(tǒng)下, 14 個(gè)玉米自交系之間GS 矩陣的相關(guān)系數(shù)為0.561 , 達(dá)到了極顯著水平(P <0.01)。這表明兩種凝膠電泳檢測(cè)系統(tǒng)在分析14 個(gè)玉米自交系遺傳變異方面可以獲得相似信息;但比較而言采用12 %聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè), 所獲得遺傳多態(tài)性信息會(huì)更豐富。

從表3 可以看出, 農(nóng)大178 , 中自451 和K12 與其他供試自交系之間具有較大的遺傳距離, 而自330 , 丹340 , 掖478 ,CA156 和K22 與其他材料之間的平均遺傳距離較小, 這在兩種凝膠系統(tǒng)下基本一致。此外, 在兩種檢測(cè)系統(tǒng)下, 均檢測(cè)出自330 和丹340 具有較大的遺傳相似性, 這種現(xiàn)象似乎與育種實(shí)踐不符, 值得進(jìn)一步研究。

3 　討論

本研究利用35 個(gè)SSR 引物和14 個(gè)玉米自交系比較分析了3 %Metaphor 凝膠和12 %聚丙烯酰胺兩種電泳系統(tǒng)對(duì)SSR 位點(diǎn)遺傳多態(tài)性的影響。從研究結(jié)果看, 3 %Metapho r 瓊脂糖凝膠在區(qū)分差異微小片段能力上不如12 %聚丙烯酰胺凝膠, 但其操作方便, 快速, 帶型容易區(qū)分, 不需要復(fù)雜的電泳裝置, 使用成本較低, 因此筆者認(rèn)為, 在遺傳作圖或基因定位研究中, 可以選用3 %Metapho r 凝膠作為檢測(cè)手段, 因?yàn)镾SR 標(biāo)記為共顯性標(biāo)記, 只要在兩親本間篩選出穩(wěn)定的多態(tài)性帶, 就可以在群體中得到體現(xiàn), 然后通過連鎖遺傳分析, 可以將其確定在染色體上。但在品種指紋圖譜分析或遺傳多樣性研究中建議采用12 %聚丙烯酰胺電泳作為檢測(cè)手段, 在這類研究中一般需要盡可能區(qū)分出各種差異片段, 這樣在品種遺傳變異分析中才能得到準(zhǔn)確結(jié)果。