木霉(T richoderma spp. )作為一種重要的植病生防因子一直受到普遍關(guān)注。研究表明, 重寄生(mycoparas itism ) 是木霉主要作用機(jī)制之一。在重寄生過程中, 木霉產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶可以破壞含有幾丁質(zhì)骨架成分的病原真菌細(xì)胞壁, 從而達(dá)到防治植物病害的效果。因此, 系統(tǒng)地研究木霉幾丁質(zhì)酶系對于了解木霉的生防機(jī)制具有重要的意義。

Harm an 等利用變性凝膠電泳首先從T.harzianum 粗酶液中檢測到幾丁質(zhì)酶。由于此法操作簡便, 分辨率高, 逐漸成為幾丁質(zhì)酶檢測的常用方法, 許多文獻(xiàn)報道利用此法檢測幾丁質(zhì)酶。但最近有資料顯示, 一些幾丁質(zhì)酶在變性電泳后不能復(fù)性, 從而顯示不出活性電泳條帶。綠色木霉LTR-2是我所篩選出的一株在國家農(nóng)藥部登記的植病生防菌( 登記證號為LS97348), 該菌株能夠產(chǎn)生大量的幾丁質(zhì)酶, 對蔬菜灰霉病和棉花立枯病等植物病害有明顯的防治效果。實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯磕久筁TR-2的幾丁質(zhì)酶同工酶系,建立一種快速檢測幾丁質(zhì)酶同工酶的靈敏方法, 為深入了解木霉的作用機(jī)理, 克隆高效幾丁質(zhì)酶編碼基因,進(jìn)而構(gòu)建基因工程菌提供有力工具。

1 材料與方法

1. 1 菌種及其培養(yǎng)基

綠色木霉(T richoderma viride ) LTR-2由本實(shí)驗(yàn)室保存。PDA培養(yǎng)基: 馬鈴薯200g, 葡萄糖20g, 瓊脂17~20g, 加水至1000m l。液體發(fā)酵培養(yǎng)基 : KNO3 10g, KH2PO4 5g, M gSO4.7H2O 2. 5g, FeCl3 2mg, 聚乙烯吡咯烷酮( PVP) 10g, 蔗糖5g, 膠體幾丁質(zhì)5g, 加水至1000m ,l pH = 6. 0。膠體幾丁質(zhì)的制備 : 稱取20g粉狀幾丁質(zhì)溶于800m l預(yù)冷的濃鹽酸中, 靜置4h, 然后倒入2L 預(yù)冷的50%的乙醇中過夜。后用蒸餾水沖洗至中性, 并用水定容到1000m l備用。

1. 2 粗酶液的制備

將綠色木霉LTR-2接種在PDA 固體培養(yǎng)基上,28度 培養(yǎng)6d后, 用無菌水洗下孢子, 四層無菌紗布過濾, 濾液為孢子懸浮液。調(diào)整孢子濃度為106 個/m ,l 然后以2% 的接種量接種到裝有100m l 液體培養(yǎng)基的500m l三角瓶中, 150r /m in, 28e 培養(yǎng)10d, 四層紗布過濾并10000 @ g 離心20m in, 上清即為粗酶液。將粗酶液冷凍干燥或用聚乙二醇濃縮5~ 20倍后透析除去其中的鹽分和色素, 作為待測樣品。

1. 3 酶活性和蛋白含量的測定

酶活性測定用DNS ( 3, 5-二硝基水楊酸) 比色法[10] 。1m l磷酸緩沖液( 0. 2mo l/L, pH 4. 5), 0. 5m l待測樣品, 0. 5m l膠體幾丁質(zhì), 混勻, 37e 恒溫水浴1h。加入DNS試劑1. 0m ,l 混勻后沸水浴10m in, 冷卻至室溫, 離心后取上清液在波長530nm 下測吸光度, 重復(fù)三次, 取平均值。以100度 高溫滅活處理一個酶活力15m in的待測樣品為對照。酶活單位定義: 每小時水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1Lmo l還原糖所需的酶蛋白量。蛋白質(zhì)含量測定用Bradford法, 以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測定。

1. 4 電泳方法

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳 。

1. 4. 1 活性凝膠電泳 分離膠濃度為12%, 濃縮膠濃度為4% 。上樣量為25Ll。前沿指示劑為0. 5%的溴酚藍(lán), 以pH 8. 8的T ris-Gly為電極緩沖液。濃縮膠電泳電壓為60V, 分離膠電泳電壓為80V, 電泳在4度下進(jìn)行, 當(dāng)指示前沿距底部0. 5cm 時停止。電泳結(jié)束后用磷酸緩沖液( 50mmol/L, pH 6. 0)浸泡5m in。

1. 4. 2 變性凝膠電泳 上樣緩沖液中加入4% SDS, 電泳緩沖液中加入0. 1%的SDS, 電泳完畢后將膠置于含1% T riton X-100的磷酸緩沖液中振蕩3h, 然后用蒸餾水浸泡5m in。其余處理同活性凝膠電泳。

1. 4. 3 原位顯色凝膠電泳 在分離膠中加入0. 5%混有0. 001%熒光增白劑Calcofluor whiteM 2R的膠體幾丁質(zhì), 加樣后進(jìn)行電泳, 具體的電泳方法同1. 4. 1。

1. 5 顯色方法

利用幾丁質(zhì)酶對底物水解后的顏色反應(yīng)顯示凝膠中的幾丁質(zhì)酶條帶。顯色平板分為以下兩種: 一種為0. 5%膠體幾丁質(zhì), 1. 5%瓊脂粉, 0. 001%的熒光增白劑( Calcofluor whiteM2R) ; 另一種為0. 5%膠體幾丁質(zhì),1. 5%瓊脂粉。這兩種平板用于活性凝膠電泳和變性凝膠電泳的酶活檢測。

變性凝膠電泳中的凝膠用1% 的tritonX-100浸泡3h, 除去其中的SDS, 平整放在兩種顯色平板上; 活性電泳膠直接放在兩種顯色平板上; 37e 培養(yǎng)7h。為了讓酶盡快滲透到平板上, 在電泳膠片上覆蓋約1mm 磷酸緩沖液。37度 培養(yǎng)完畢后, 含有熒光增白劑的平板放到紫外燈下顯示黑色條帶, 不含熒光增白劑的平板直接在可見光下觀察透明帶。

對于原位顯色電泳, 則在電泳結(jié)束后直接將電泳膠浸泡在5mm 磷酸緩沖液中, 37度培養(yǎng)7h, 于紫外光下觀察染色譜帶。

1. 6 幾丁質(zhì)酶分子量的確定

將活性凝膠電泳中有活性的蛋白譜帶切下, 用磷酸緩沖液洗滌3次, 再用蒸餾水洗滌3次, 然后用吸管將膠條表面上的蒸餾水除盡并搗碎, 加入液氮研磨后溶解于適量的磷酸緩沖液中。10000 @ g 離心, 上清即為幾丁質(zhì)酶液。為獲得足夠量的幾丁質(zhì)酶, 上述步驟可以重復(fù)幾次。將得到的酶液經(jīng)冷凍干燥濃縮后, 進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 考馬斯亮藍(lán)染色確定幾丁質(zhì)酶的分子量。

2 結(jié)果分析

2. 1 電泳樣品酶活性測定

綠色木霉LTR-2中幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量較低, 直接利用沒有濃縮的酶液進(jìn)行電泳, 無論用何種電泳和檢測方法都不能觀察到幾丁質(zhì)酶條帶, 因此利用冷凍干燥和聚乙二醇濃縮粗酶液。利用DNS比色法和Bradford法測得粗酶液和不同倍數(shù)濃縮液的幾丁質(zhì)酶活力及蛋白含量。

2. 2 活性凝膠電泳

活性凝膠電泳結(jié)束后, 采用兩種顯色方法。一是將凝膠直接平鋪到含熒光增白劑的幾丁質(zhì)染色平板上, 5倍濃縮的粗酶液經(jīng)電泳分離后在含熒光增白劑的平板上顯色情況如圖1所示, 可見兩條清晰的活性條帶, 根據(jù)分子量大小分別命名為CH I65和CH I42; 將同樣處理的聚丙烯酰胺凝膠膠片平鋪到不含熒光增白劑的幾丁質(zhì)O瓊脂平板上, 則檢測不到幾丁質(zhì)酶活性, 但將粗酶液進(jìn)一步濃縮到20倍, 則在幾丁質(zhì)平板上顯出明顯的條帶(圖2)。這說明含有熒光增白劑的顯色平板靈敏度明顯高, 其檢測靈敏度可達(dá)0. 47U。

2. 3 變性凝膠電泳

5倍濃縮的粗酶液經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳并復(fù)性后, 在含有熒光增白劑的平板上沒有檢測到清晰條帶; 10倍濃縮液和20倍濃縮液電泳并復(fù)性后只顯示CH I65一條活性譜帶(圖3), 說明變性凝膠電泳的靈敏度不如活性電泳凝膠高, 檢測到的酶種類減少, 不適合于同工酶譜的檢測。

2. 4 原位顯色電泳

5倍和10倍濃縮的粗酶液經(jīng)原位水解電泳后在含有熒光增白劑的平板上基本檢測不到活性條帶。20倍濃縮液電泳后顯色結(jié)果如圖4。幾丁質(zhì)酶電泳譜帶呈彌散形, 并且條帶不清晰。這表明, 原位顯色電泳可以保持同工酶的活性, 但是需要較大的酶量。

2. 5 分子量的確定

切膠純化后的幾丁質(zhì)酶經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分別呈現(xiàn)一條單一的譜帶, 結(jié)果如圖5, 兩種幾丁質(zhì)酶的分子量分別是65kDa和42kDa。分子量為42kDa的幾丁質(zhì)酶在木霉中普遍存在, 許多文獻(xiàn)報道了對該種酶的分離純化 。而對于分子量為65kDa的幾丁質(zhì)酶在木霉中未見報道, 可能為一種新的幾丁質(zhì)酶。

3 討 論

在幾丁質(zhì)酶活性研究中應(yīng)用最多的是變性凝膠電泳。但是該方法有一些不足之處。首先, 變性凝膠電泳結(jié)束后要進(jìn)行復(fù)性才能進(jìn)行酶活性檢測, 復(fù)性過程中酶的活性有損失, 這將導(dǎo)致一些含量低的幾丁質(zhì)酶同工酶檢測不到, 降低了電泳檢測的靈敏度; 其次, 一些酶在變性電泳后不能復(fù)性, 例如CHIT73在復(fù)性后就檢測不到活性。本研究中綠色木霉LTR-2的CH I42在復(fù)性后也沒有檢測到活性。

T rudel等曾經(jīng)報道利用原位水解方法進(jìn)行幾丁質(zhì)酶檢測, 但是這種水解方法需要一種昂貴的乙二醇幾丁質(zhì)來代替膠體幾丁質(zhì)作為反應(yīng)底物, 并且由于在電泳膠中加入的乙二醇幾丁質(zhì)能部分結(jié)合幾丁質(zhì)酶,影響了幾丁質(zhì)酶的電泳速率, 從而使幾丁質(zhì)酶電泳譜帶呈彌散形, 很難形成明顯的單一電泳譜帶。在本實(shí)驗(yàn)過程中, 由于在凝膠中加入了不溶性膠體幾丁質(zhì),它不僅部分結(jié)合了幾丁質(zhì)酶, 還形成分子排阻現(xiàn)象, 對幾丁質(zhì)酶的電泳的速率影響更大, 導(dǎo)致在凝膠上看不到清晰的電泳圖譜。但是在酶量足夠大的情況下, 該方法能夠用來檢測同工酶的種類, 只是同活性電泳相比靈敏性較差。

活性凝膠電泳在幾丁質(zhì)酶檢測過程中應(yīng)用較少,但是該電泳不需要變性-復(fù)性這一過程, 電泳后可直接將凝膠平鋪到平板上顯色, 減少了丟失酶的可能性。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。在染色方法相同的情況下,活性凝膠電泳的檢測靈敏度是變性凝膠電泳的近2倍, 是原位凝膠電泳的4倍, 并且顯色清晰。因此活性凝膠電泳適合于分離不同分子量的同工酶。

熒光增白劑CalcofluorwhiteM 2R能和膠體幾丁質(zhì)結(jié)合在紫外燈下顯示藍(lán)色背景, 當(dāng)幾丁質(zhì)被分解后失去熒光顯黑色條帶。由于CalcofluorwhiteM2R的分辨率非常高, 所以廣泛應(yīng)用于熒光顯微技術(shù)中。據(jù)報道利用熒光增白劑進(jìn)行幾丁質(zhì)酶活性顯色的靈敏度可以達(dá)到0. 5U 左右[13] 。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看, 顯色靈敏度為0. 47U, 與文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)相近, 但是在總酶活相近的情況下利用熒光增白劑顯色能夠檢測到兩條活性帶, 所以該方法適合于同工酶的檢測。

綜上所述, 活性聚丙烯酰胺凝膠電泳和CalcofluorwhiteM 2R顯色相結(jié)合的方法, 在檢測木霉幾丁質(zhì)酶同工酶時具有良好的分辨率和靈敏度。采用此種方法,在綠色木霉LTR-2發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了兩種幾丁質(zhì)酶同工酶, 分子量分別為65kDa和42kDa。該方法簡便、快捷、靈敏性高, 是檢測木霉幾丁質(zhì)酶同工酶的有效方法。