摘要　評述了近年來熒光分光光度計的發(fā)展, 介紹了國內(nèi)熒光分光光度計的研制及生產(chǎn)情況, 綜述了熒光分析技術(shù)的應用。

近年來, 我國在熒光分光光度分析技術(shù)領域的研究取得了許多新的進展。如熒光總發(fā)光光譜技術(shù)、熒光探針、光纖熒光傳感器、激光誘導時間分辨發(fā)光技術(shù)、熒光薄層掃描技術(shù)、動力學熒光法等。因此, 對熒光分光光度計的要求不斷提高。目前國內(nèi)生產(chǎn)熒光分光光度計的廠家較少, 國外廠商提供的都是中高檔的熒光分光光度計。研制和生產(chǎn)性能可靠的國產(chǎn)熒光分光光度計具有重要意義。

1　基本原理

當激發(fā)光照射某些物質(zhì)時, 處在基態(tài)的分子吸收激發(fā)光后躍遷為激發(fā)態(tài), 這些激發(fā)態(tài)分子在因轉(zhuǎn)動、振動等損失一部分激發(fā)能量后, 以無輻射躍遷下降到低振動能級, 再從振動能級下降到基態(tài), 在此過程中激發(fā)態(tài)分子將以光的形式釋放出它們所吸收的能量, 這種光稱之為熒光, 所得到的光譜稱為熒光光譜。熒光光譜能夠反映熒光物質(zhì)的特性。熒光分光光度計是基于物質(zhì)的這種性質(zhì)而對其進行定性及定量分析的一種分析儀器。熒光定量分析的數(shù)學處理比分子吸收光譜復雜。一般來講, 熒光強度I f 等于分子所吸收輻射的光強度I a與量子效率 的積[ 1] ,即I f = f ·I a = f I0(1 -10

-εbc)。如果熒光物質(zhì)的濃度足夠低, 則I f =2 .3 f I 0εbc =kc 。這就是熒光定量分析的理論公式, 式中ε、b 、c 分別是摩爾吸光系數(shù)、液池厚度及被測物質(zhì)的濃度。

2　熒光分光光度計的基本結(jié)構(gòu)

熒光輻射是從樣品發(fā)生的, 其在所有方向發(fā)射都相同, 原則上可以從任何角度進行觀測。但從儀器設計和應用的觀點來看, 90°角度是最方便且是目前使用較為廣泛的方式。

熒光分光光度計的基本結(jié)構(gòu)是:光源※單色器或濾光片※樣品池※單色器或濾光片※檢測器。目前熒光分光光度計的常用光源為氙燈, 單色器多用柵, 檢測器主要用光電倍增管, 普通熒光分光光度計的激發(fā)和發(fā)射波長一般在200 ～ 900 nm 。

3　熒光分光光度計的分類

3.1　濾光片式熒光計

3.1.1　單光束濾光片熒光計

單光束濾光片熒光計的工作原理是第1濾光片允許紫外線(激發(fā)光)通過, 第2 濾光片可以透射熒光輻射, 但它吸收了任何能向光電池散射的光, 對于這類儀器來講, 光電管及燈的穩(wěn)定性要求比較高, 否則會引起較大測量誤差。

3.1.2　雙光束濾光片熒光計

貝克曼比例熒光計屬于此種類型儀器,它是采用一種特殊設計的汞蒸氣燈, 具有斬光器作用, 使樣品和標準各接收60 Hz 的相同輻射脈沖并為短的暗間隔所分開, 從而保持一個恒定的參比水平。這類儀器消除了由于線路電壓波動所引起的變化, 具有較高的穩(wěn)定性。

3.2　熒光分光光度計

3.2.1　單光束熒光分光光度計在熒光光譜定量分析中, 濾光片式熒光計由于有較高的輻射照到樣品上而具有較高的靈敏度, 但因它易引起光譜干擾而逐漸被熒光分光光度計所取代。最早, 單光束熒光分光光度計作為紫外可見分光光度計的一個附件儀器, 從光源到探測器只有一束測量光。在測量時, 參比和樣品交替進行, 因而較易引起測量誤差。

3.2.2　雙單色器單光束熒光分光光度計這類熒光分光光度計是90°角照射樣品, 結(jié)合兩個光柵單色器的單光束儀器。它是由氙燈發(fā)出激發(fā)光, 經(jīng)過激發(fā)單色器分出的單色光照射到樣品上, 然后使發(fā)射單色器接收熒光到檢測器。

3.2.3　雙單色器雙光束熒光分光光度計

這類儀器將從光源來的輻射在穿過第一個單色器照射到液池之前分成兩路, 這可用斬波器或光束分離器來完成。分光后一部分輻射通過液池及第二個單色器照在檢測器上, 而另一束輻射從液池及第二單色器的側(cè)旁經(jīng)過照在檢測器上。如果以斬波器來分光, 則可使用一個單獨檢測器輪流測定來自兩光束的輻射;如果使用光束分離器, 則需要第二個檢測器來測量參比光束的強度。在這兩種情況下, 熒光光譜都由測得的來自樣品發(fā)射強度與作為波長函數(shù)的參比光束強度的比值組成。PE 公司LS_5 型及日立公司FRS_100 型熒光分光光度計分別屬于上述兩種情況。

還有一類雙光束熒光分光光度計是將從光源輻射的光分為兩束, 一束通過液池而另一束用作參比。第二束往往要通過一個參比溶液或在測定前作強度衰減, 在許多儀器中采用了零點測定法, 即利用衰減器將參比光束在檢測器上的響應值調(diào)節(jié)到與樣品的發(fā)射在檢測器上的響應值相同, 然后讀得衰減器上此時所調(diào)定的值, 可利用同一檢測器交替測量這兩光束, 或以不同的檢測器同時測定。第三類雙光束熒光分光光度計是以美國

Turner 公司生產(chǎn)的210 型熒光分光光度計為代表。它具有激發(fā)光光源和參比燈的兩道光束, 交替地照射于測量輻射器上, 參比燈在固定波長的強度是可變的, 由光平衡系統(tǒng)調(diào)節(jié)參比燈的能量使其與激發(fā)光的能量相同,從參比燈發(fā)出的另外一束光通過衰減器到達光電倍增管檢測器。衰減器是由一個與發(fā)射單色器聯(lián)結(jié)的傳動輪所驅(qū)動, 這使得光電倍增管的光譜感應與發(fā)射單色器的光譜特性的組合得到補償, 因此交替照射于光電倍增管上的是一束經(jīng)過校正的能量恒定的光束和一束由試樣發(fā)射的熒光, 在整個掃描的波長范圍內(nèi)記錄兩道光束在每一波長的比率所得到的曲線就是絕對熒光光譜。

3.2.4　激發(fā)和發(fā)射均為雙單色器的熒光儀Spex 公司的Fluorolog_2 系列儀器的激發(fā)和發(fā)射均為雙單色器, 這種儀器減少了雜散光的干擾, 對于生物樣品等光散射比較強的樣品測定十分有利。這類儀器靈敏度非常高, 穩(wěn)定性十分好。

4　熒光分光光度計的發(fā)展

由于熒光分光光度計靈敏度高、特異性強, 因此應用范圍較為廣泛。但由于它對樣品有一定要求, 所以目前還不屬于實驗室的常規(guī)儀器, 一般用于科研工作, 目前使用的熒光分光光度計以國外中高檔儀器為主。

4.1　國外熒光分光光度計

目前進入中國市場的外國廠商主要有日立公司、島津公司以及美國的PE 公司等。這些公司的儀器性能指標如表1 所示。表1　國外最新熒光分光光度計性能指標比較參數(shù)項日立F_4500 PE LS_50B島津RF_5301PC光源150 W 氙燈8 .3W/ 50Hz 氙燈8 .9W/ 60Hz 氙燈150W 氙燈掃描范圍λex 、λem200 ～ 900 nmλe x200 ～ 800 nmλem200 ～ 900 nmλex 、λem220～ 900 nm分辨率1.0 nm 2.5 nm 1 .5 nm波長精度±2 nm ±1 .0 nm ±1.5 nm最少取樣量0 .6 mL 2 mL 2 mL從表1 可以看到使用脈沖作為光源是PE 公司LS_50B 的特點, 該光源的使用可降低氙燈的功率, 節(jié)約能源, 延長使用壽命。而波長掃描速度的改觀在日立公司儀器中具有明顯的優(yōu)勢。另外日立公司推出的F_4500型熒光分光光度計采用水平光束測量, 樣品

量只需0 .6 mL , 這對痕量分析大有益處。雖然熒光分光光度計近年來在光學系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)方面沒有明顯改觀, 但是隨著計算機軟件的飛速發(fā)展, 熒光分光光度計的應用軟件系統(tǒng)不斷完善, 各大公司均提供了許多用戶歡迎的應用軟件, 使儀器的操作及數(shù)據(jù)處理自動化程度提高。

4.2　國內(nèi)熒光分光光度計的應用與研制

70 年代末期以來, 國內(nèi)高等院校及科研單位逐漸引進了中高檔熒光分光光度計。筆者統(tǒng)計了1996 年《分析化學》雜志刊載熒光分析方面的文章表明, 國外儀器使用率高達85 %以上。常用的儀器型號為日立540 、日立RF_3010 、島津RF_5000 , 日立及島津公司的熒光分光光度計在國內(nèi)市場中占有絕對優(yōu)勢。中國科學院系統(tǒng)研究單位在70 年代引進國外熒光儀器3 臺, 80 年代引進13 臺,1990 ～ 1995 年引進6 臺。由此情況可見國內(nèi)引進儀器形勢。國外高檔儀器的引進, 對我國熒光分析技術(shù)的發(fā)展起到明顯的推動作用。

國內(nèi)熒光分光光度計的研制起步較晚,多為自行裝配, 而商品化的儀器不多, 已形成商品化的儀器有:天津光學儀器廠生產(chǎn)的WFD 系列產(chǎn)品, 廈門分析儀器廠生產(chǎn)的GFY 系列以及與廈門大學合作研制的YF型系列產(chǎn)品。另外上海第三分析儀器廠先后生產(chǎn)幾種型號熒光分光光度計, 如970MC 型熒光分光光度計, 目前國內(nèi)廈門大學化學系對熒光儀的研制和開發(fā)做了大量工作;國內(nèi)有一些單位研究激光熒光光譜儀, 如核工業(yè)部化工冶金研究所研制的時間分辨激光熒光光譜儀, 靈敏度比普通熒光光度計高十幾倍;中國科學院安徽光學精密機械研究所研制的時間分辨熒光生化(免疫)分析儀, 采用鑭系元素標液生化分析, 其靈敏度、特異性、穩(wěn)定性均可與同位素標液方法相媲美。南開大學開發(fā)一種便攜式熒光光譜儀采用光纖采樣輸入,CCD 陣列接收, 筆記本微機數(shù)據(jù)處理技術(shù), 特別適合于在線和野外工作。光纖熒光傳感器的應用給熒光分析儀器注入活力, 而電荷轉(zhuǎn)移檢測器的引入大大改善了熒光分析儀器的性能。