造成透射光強(qiáng)I t 變化的除散射、介質(zhì)的吸光, 還有界面間的反射、透射損耗等, 這些都會(huì)造成偏離朗伯-比爾定律, 下面針對(duì)這些因素造成的

影響進(jìn)行一定的分析。

3. 1 正入射光線對(duì)透射光強(qiáng)的影響分析

當(dāng)電磁波從一種介質(zhì)傳播到另一種介質(zhì)時(shí),由于介質(zhì)表面的物理性質(zhì)不同, 造成電磁場(chǎng)在界面上不連續(xù)[ 6, 7] 。由菲涅耳相關(guān)理論可以得知,

當(dāng)入射角小于45b時(shí), 反射比Qn 幾乎不變, 與正入射時(shí)相近[ 6] , 其反射比Qn= n- 1n+ 12, ( 2)其中n= n2 / n1 ,在本設(shè)計(jì)中, 透過(guò)樣品池的光線幾乎是正入圖5 樣品池的光學(xué)特性Fig. 5 Sample cell. s o ptical char acteristics射, 入射角均小于45b, 光學(xué)特性如圖5 所示。在兩界面上的反射率均為Qn , 因光在界面1 上的反射造成的入射光強(qiáng)變化值:

3. 2 傾斜光線對(duì)透射光強(qiáng)的影響分析

后分光光度計(jì)對(duì)寬光譜段進(jìn)行準(zhǔn)直時(shí), 由于像差的存在, 透過(guò)樣品池的光線必然傾斜, 下面就傾斜光線對(duì)透射光強(qiáng)的影響進(jìn)行分析。樣品池可以看作一個(gè)平行平板, 如圖5 所示。由平行板的側(cè)向位移[ 7]式中, n1 樣品池側(cè)壁的折射率、n 2 為待測(cè)介質(zhì)的折射率、d 是樣品的沿光線傳播方向的距離?？梢?jiàn), 對(duì)側(cè)向位移$T 和軸向位移$L 有影響的參數(shù)有n1 、n2、I 1和d, 在實(shí)際的分光光度計(jì)中, d 是固定的, 大多數(shù)的分光光度計(jì)的d 為10 mm, 小型化的儀器為6 mm 左右。對(duì)系統(tǒng)的光強(qiáng)變化有直接影響的是側(cè)向位移$T , 僅對(duì)$T的影響參數(shù)進(jìn)行一定的分析。$T 隨著n2、I 1 的

變化的關(guān)系曲線如圖6 所示, 其中樣品池的折射率n1 = 1. 45, d = 6 mm。

由圖6 中可以看出:

A. 當(dāng)被測(cè)試介質(zhì)( 液體或空氣) 的折射率n2和樣品池的折射率n1 的相差越大時(shí), 光斑的側(cè)向位移越大。

B. 當(dāng)光線傾斜角I 1 越大, 光斑的側(cè)向位移越大。對(duì)于一個(gè)已經(jīng)制備好的分光光度計(jì)而言, I1已經(jīng)固定, 由公式( 9)、( 10) 和圖6 看出, 任何和樣

品池折射率不同的介質(zhì)都會(huì)造成光斑的側(cè)向位移, 但是當(dāng)參比介質(zhì)的折射率和被測(cè)試介質(zhì)的折射率接近時(shí), 會(huì)使得兩者的側(cè)向位移相近, 但是實(shí)

際測(cè)試中很難找到兩種折射率一致的物質(zhì), 因此需要分析側(cè)向位移對(duì)透射光強(qiáng)的影響。假設(shè)出射光斑的光照度( 光強(qiáng)) 沿徑向方向是均勻分布, 且

本系統(tǒng)中近軸視場(chǎng)光闌和光斑的初始位置重合,如圖7 中白色光斑所示。

圖7 透射光斑的側(cè)向位移原理圖Fig . 7 Schematic diag ram o f the tr ansmit ted lig ht

當(dāng)有側(cè)向位移時(shí), 就會(huì)有部分光斑/ 溢出0, 從而造成光強(qiáng)的變化, / 溢出0部分如圖7 中陰影部分所示, 其面積經(jīng)數(shù)學(xué)推導(dǎo)結(jié)果為

光斑的總面積

S= PR2 , ( 12)/ 溢出0部分光斑勢(shì)必會(huì)造成能量的變化, 能量的變化率就可以簡(jiǎn)單地表示成/ 溢出0部分光斑面積和總面積的比值, 即

根據(jù)上式作出透射光強(qiáng)的變化率和光線的側(cè)向位移$T 、光斑的半徑R 的關(guān)系圖, 如圖8 所示。其中$T 在- 1~ 1 Lm 之間變化, R 在0. 2~ 10 mm

之間變化。圖8 $I t2 / I t 和$T, R 關(guān)系圖Fig . 8 Relation betw een $T, R and $I t2 / I t由圖8 可以看出$T 越小、R 越大則$I t2 / I t越小。三者之間存在制約關(guān)系, 任何一個(gè)參數(shù)的選擇應(yīng)該綜合考慮其它兩個(gè)參數(shù)的變化是否在系統(tǒng)的承受范圍之內(nèi)。但是從圖8 中可以看出一系列明顯的拐點(diǎn), 即變化的陡峭點(diǎn)。這些拐點(diǎn)是儀器的微型化與儀器光學(xué)性能之間的一個(gè)平衡點(diǎn),是參數(shù)優(yōu)化配置的一個(gè)重要參數(shù)。由圖8 中可以看出, 當(dāng)R= 1mm, $T = 1 Lm 時(shí), $I t2 / I t 會(huì)突然變化, 此點(diǎn)即為拐點(diǎn)之一。

3. 3 光強(qiáng)變化對(duì)吸光度的影響

當(dāng)入射光強(qiáng)I 0 變化$I 0 , 透射光強(qiáng)I t 變化vI t 時(shí), 對(duì)應(yīng)的吸光度A 變化$A 時(shí), 那么朗伯-比爾方程變?yōu)锳+ $A= log( I 0- $I 0 ) - log ( I t- $I t ) , ( 15)上式微小量$I t 、$A 求微分整理得:由上述分析可以有下推論:

( 1) 由于參比溶液的折射率和被測(cè)試介質(zhì)的

折射率不同, 必然造成吸光度和濃度之間的關(guān)系擬合曲線(A-C 曲線) 不過(guò)原點(diǎn), 兩者相差越大, 與原點(diǎn)的距離$A 越大。( 2) 僅對(duì)各個(gè)點(diǎn)的A/ 平移式0增加, 即采用不同的參比溶液, 兩者之間的平移量不同, 但是不會(huì)對(duì)線性度、A-C 曲線斜率有影響。

( 3) 在入射光強(qiáng)相同并且被測(cè)介質(zhì)一般吸收,當(dāng)被測(cè)試介質(zhì)的折射率和樣品池的折射率越近,透射光強(qiáng)越大。當(dāng)兩種被測(cè)介質(zhì)的透射光強(qiáng)相比時(shí), 透射比是否超過(guò)100%, 取決于兩者的折射率和樣品池的折射率的接近狀況。

4 吸收光譜實(shí)驗(yàn)和分析

4. 1 介質(zhì)折射率不同的透射光強(qiáng)的測(cè)試用所研制的微型分光光度計(jì)測(cè)試三種不同折射率的介質(zhì)的光譜如圖9 所示, 其中三種介質(zhì)在K= 750 nm 附近屬于一般吸收。由圖9 可以看出, 三者的透射光強(qiáng)關(guān)系為I tA ir < I tWater < I tCoCl2 ,具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1, 隨著被測(cè)試介質(zhì)折射率和樣品池的折射率的接近, 透射光強(qiáng)I t 也增加, 驗(yàn)證了

3. 3 中論述和分析。此現(xiàn)象已經(jīng)超越朗伯-比爾

定律的解釋范圍, 但是屬于正常的測(cè)試現(xiàn)象。同時(shí)可以利用此規(guī)律測(cè)試未知介質(zhì)的折射率, 表1可以看出, 本系統(tǒng)可以測(cè)試折射率相差0. 01 的兩

種介質(zhì)。圖9 不同介質(zhì)在750 nm 附近光譜Fig. 9 Spectr um o f different medium near 750 nm表1 不同介質(zhì)的折射率和透射光強(qiáng)

4. 2 線性吸光度溶液的測(cè)試和分析

線性吸光度溶液采用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心調(diào)配的CoCl2 稀酸溶液[ 8] , 吸收光譜如圖10 所示,其中參比溶液為蒸餾水。由圖10 可以看出體系的測(cè)試吸收峰值和理論值510 nm 基本吻合。當(dāng)相對(duì)濃度較大時(shí), 溶液的吸光度也較大, 由布格-朗伯-比耳定律知透過(guò)溶液的輻射強(qiáng)度將會(huì)很弱,此時(shí)系統(tǒng)的隨機(jī)噪聲對(duì)系統(tǒng)的的測(cè)試影響較大,故圖10 中吸光度較大時(shí)吸光度的工作曲線不平滑。當(dāng)選擇不同參比溶液時(shí), CoCl2 吸光度值如表2 所示?？梢?jiàn)由參比的不同造成了吸光度的不同, 對(duì)A-C 曲線的線性度影響見(jiàn)下面分析。圖10 CoCl2 吸收光譜

Fig . 10 CoCl2 absor bing cur ves表2 CoCl2 吸光度數(shù)據(jù)表Tab. 2 Abso rbency of CoCl2

3. 2 0. 268 94 0. 178 60

8. 0 0. 671 36 0. 575 80

10 0. 837 79 0. 748 77

14 1. 192 74 1. 113 39

18 1. 509 01 1. 416 22

對(duì)A-C 曲線進(jìn)行一元線性回歸, 令其方程式為y^ = a+ bx , ( 19)式中y^ 為吸光度回歸值, x 為相對(duì)濃度值, a、b 為回歸系數(shù), 其具體表達(dá)式參見(jiàn)文獻(xiàn)[ 9] 。把表2 中的數(shù)據(jù)帶入文獻(xiàn)[ 9] 相關(guān)公式, 計(jì)算的結(jié)果如表3所示, 其中r 為相關(guān)系數(shù), R為殘余標(biāo)準(zhǔn)差, N-2 為自由度。也可以利用origin 軟件進(jìn)行相關(guān)計(jì)算和繪圖, 做出的直線擬合曲線如圖11 所示。由表3和圖11 可以看出, 盡管以空氣為參比時(shí)的吸光度整體都比水為參比時(shí)的吸光度小, 但是線性相關(guān)系數(shù)r 和A- C 直線斜率b 幾乎一樣, 進(jìn)一步說(shuō)明了因被測(cè)介質(zhì)折射率變化引起的透射光強(qiáng)的變化對(duì)系統(tǒng)的吸光度A 的影響僅僅限于$A , 并且當(dāng)參比介質(zhì)和被測(cè)介質(zhì)的折射率越接近, $A 越小,如表3 中a 值。同時(shí)說(shuō)明參比介質(zhì)和被測(cè)介質(zhì)的折射率越接近時(shí), A-C 曲線將是一條過(guò)原點(diǎn)高度線性相關(guān)的直線, 且相應(yīng)的回歸殘余標(biāo)準(zhǔn)差越小(R= 0. 009 31) 。對(duì)于一元線性回歸方程而言, 當(dāng)自由度為3、顯著水平為0. 001 時(shí), 其臨界值

r( 0. 001; 5- 2) = 0. 991 2[ 10] 。本系統(tǒng)中r >r( 0. 001; 5- 2) , 故系統(tǒng)的線性相關(guān)性為高度顯著相關(guān)。

圖11 CoCl2 工作曲線Fig. 11 CoCl2 w or king curves表3 CoCl2 吸光度線性擬合表Tab. 3 Linear fit Abso rbency of CoCl2Pa rameterAbso rbency

( Water as Refer ence)Absorbency( Air as Refer ence)

a - 0. 000 81 - 0. 092 86

b 0. 084 28 0. 084 53

r 0. 999 86 0. 999 59

R 0. 009 31 0. 015 79

N- 2 3 3

5 結(jié) 論

基于MEMS 技術(shù)研制出了具有體積小、分辨率高、高度線性相關(guān)的微型分光光度計(jì)。采用MEMS 技術(shù)的微硅片狹縫、微定位器, 具有體積小、精度高、易于批量化制作的特點(diǎn), 克服傳統(tǒng)機(jī)械加工的諸多缺點(diǎn)。通過(guò)對(duì)樣品池光學(xué)特性的進(jìn)行分析, 論證了被測(cè)試介質(zhì)的折射率對(duì)透射光強(qiáng)和吸光度的影響, 為相關(guān)的實(shí)驗(yàn)測(cè)試提供了理論指導(dǎo)。最后通過(guò)對(duì)透射光強(qiáng)的測(cè)試結(jié)果表明, 該微型分光光度計(jì)可以分辨出折射率相差0. 01 的兩種介質(zhì), 為該系統(tǒng)在測(cè)試分辨率方面提供了應(yīng)用前景。同時(shí)通過(guò)測(cè)試以空氣和蒸餾水為參比溶液時(shí)CoCl2 稀酸溶液的吸光度, 進(jìn)一步驗(yàn)證了關(guān)于被測(cè)介質(zhì)折射率變化對(duì)吸光度A 的影響, 僅僅限于$A , 而與A-C 斜率無(wú)關(guān), 并且結(jié)果顯示兩者的相關(guān)系數(shù)r 都大于0. 999, 屬于高度顯性相關(guān),這為基于MEMS 的微型生化分析儀提供了一個(gè)高度線性相關(guān)光度分析平臺(tái)。尤其是光纖和MEMS 技術(shù)的結(jié)合, 為微型分光光度計(jì)遠(yuǎn)程式、網(wǎng)絡(luò)化、無(wú)線操作、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)在線監(jiān)測(cè)、數(shù)據(jù)的共享等提供了廣闊的應(yīng)用空間。