超氧化物歧化酶( EC1-15.1.1, 簡稱SOD)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類金屬酶, 根據(jù)金屬輔基的不同可分為Mn-SOD、Fe-SOD 和CuZn-SOD 3種類型, 近年來還從鏈霉菌屬中發(fā)現(xiàn)了N i-SOD, 從日本沼蝦中純化66.1 ku的EC-SOD, 發(fā)現(xiàn)了倉鼠和人胞質(zhì)中的240~ 260 ku及135和270 ku的EC-SOD , 它們都具有催化超氧陰離子自由基形成過氧化氫和水的反應(yīng)能力, 在防御活性氧對生物體的傷害、在植物的逆境生理、在預(yù)防和治療由自由基誘發(fā)的一系列疾病, 如腫瘤、輻射損傷、心腦血管疾病等方面都起到了很重要的作用. 對3種類型SOD同工酶的分離和鑒定是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中會遇到的實際問題, 通常都是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳( PAGE )的定位染色法 , 我們在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)樣品點樣量少時, SOD 弱帶難以顯示,點樣量大時植物次生物質(zhì)對酶帶顯示有干擾, 且譜帶清晰度和重復(fù)性都不理想, 時有譜帶重疊現(xiàn)象出現(xiàn),譜帶分離的Rf值與酶類型間無特定規(guī)律可尋, 在改用聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳( GPGE )后得到了較滿意的效果. 本文將通過GPGE和PAGE 的比較, 旨在建立用GPGE 分離和鑒定SOD同工酶的新方法.
1. 材料和方法
1.1 材料、主要試劑及儀器
新鮮的植物材料采自南京地區(qū)和本院溫室, 當(dāng)天采集后, 用蒸餾水洗凈后備用.枸杞Fe-SOD、牛血SOD及花生CuZn-SOD分別按其文獻(xiàn) 純化至電泳純. 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、甲硫氨酸( Sigma) , NBT(南京卓爾生化有限公司), 其它試劑為國產(chǎn)分析純或生化試劑. 主要儀器為島津CS- 9000雙波長薄層掃描儀, CSR- 4高壓電泳儀, 梯度凝膠電泳灌膠裝置.
1.2 方法
1.2.1 SOD粗酶液的制備
將實驗材料剪碎, 按每克鮮重加入3mL 的50mmo l/L 磷酸緩沖液( pH7??8) 進(jìn)行研磨勻漿, 勻漿液10 000 r /m in離心15m in后, 上清液即為粗酶液, 用于實驗或分裝于小離心管內(nèi), - 25?? 保存?zhèn)溆?
1.2.2 SOD同工酶的電泳分離和染色定位
PAGE 按羅廣華等 方法, 在7.5%或10% 的分離膠上進(jìn)行; GPGE 按程光宇等及張龍翔方法, 在4% ~ 35%梯度膠上進(jìn)行, 加樣前以100 V穩(wěn)壓預(yù)電泳30m in, 加樣后在4 電泳, 先以150V 穩(wěn)壓電泳1 h后, 將電壓逐步提高到300V 穩(wěn)壓電泳15 h(電泳持續(xù)4 500 V h以上) ; 二次電泳按程光宇等[ 9] 方法進(jìn)行, 第一向為10%的PAGE, 在電泳結(jié)束后切取具有SOD 活性且未經(jīng)染色的區(qū)帶, 放在已預(yù)電泳過的4%~ 35%梯度膠上端, 加入PAGE 中3??5%的濃縮膠液, 采用光照聚合將其固定后進(jìn)行第二向GPGE, 同時以相同酶液量在梯度膠上點樣. 電泳結(jié)束后進(jìn)行酶活性染色, 采用拍照或掃描方法記錄SOD 同工酶圖譜.
1.2.3 SOD同工酶類型的鑒定
( 1) 參照Bridges和Sa lin 的方法[ 10] , 以KCN 和H2O2 兩種抑制劑鑒定SOD類型.
( 2) 利用梯度膠具有分子篩效應(yīng)[ 8] 及其Rf 值與3種SOD相對分子質(zhì)量存在差異 的特點, 由Rf 值初步判斷SOD類型.
( 3) 利用CuZn-SOD 對SDS不敏感、Mn-SOD 和Fe-SOD 對SDS敏感的特性, 向粗酶液中加入SDS溶液使其終濃度達(dá)1%后, 于37 保溫1 h, 分別進(jìn)行SOD 同工酶的GPGE 和PAGE 并進(jìn)行酶活性染色. CuZn-SOD 對SDS不敏感, 譜帶留存, Mn-SOD和Fe-SOD 對SDS敏感, 譜帶消失.
2 結(jié)果與分析
2.1 GPGE 和PAGE對分離SOD同工酶的影響
結(jié)果見圖1. 14種植物的3種類型SOD在4% ~ 35%的梯度膠中都得到較好的分離, 譜帶清晰, 未見有干擾現(xiàn)象, 根據(jù)Rf 值可分為A、B、C 3個區(qū)域: A區(qū)的Rf 值最小( < 3.6) , 譜帶都為1條; C 區(qū)的Rf 值最大( > 5.0), 其中譜帶數(shù)目因植物種類不同而異, 如羊蹄、拔契僅有1~ 2條, 而鴨趾草、馬兜鈴等則多于4條; B區(qū)Rf值位于A、B區(qū)之間, 如有譜帶一般都為1條, 但許多植物缺乏這種類型譜帶. 同時, 從其Rf 值大小, 還可初步判定各同工酶的相對分子質(zhì)量和類型, Rf 值最小的A 區(qū)同工酶相對分子質(zhì)量最大, 應(yīng)為Mn-SOD; Rf最大的C 區(qū)同工酶相對分子質(zhì)量最小, 應(yīng)是CuZn-SOD; 而介于兩者之間B 區(qū)的同工酶可認(rèn)為是Fe-SOD, 如南苜蓿、金蕎麥的Fe-SOD. 在SOD 類型的篩選中, 利用梯度膠這一分離特性為初步判斷SOD類型提供了一條快捷途徑.同一樣品在相同加樣量下進(jìn)行10% PAGE, SOD 譜帶分離效果遠(yuǎn)不如GPGE, 譜帶分布及Rf 值與SOD類型之間無特定規(guī)律可尋, 其中紫花地丁中的次生物質(zhì)對SOD 顯示干擾并影響到周圍的譜帶(圖1的11) . 可見, 在PAGE 中SOD 的Rf 值因受電荷、膠濃度、pH值等多種因素影響, 不能作為SOD類型鑒定的依據(jù), 在GPGE中的Rf 值排除了電荷等因素的影響, 與分子大小有相關(guān)性, 故它可用于測定天然酶和蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量.
2.2 GPGE 和PAGE檢測SOD的靈敏度和分辨率比較
以牛血SOD為標(biāo)準(zhǔn), 比較GPGE 和PAGE檢測SOD的靈敏度和分辨率(見圖2). 當(dāng)以相同加樣量分別進(jìn)行GPGE 和PAGE時, 在PAGE圖譜上SOD的檢測濃度為1.56 10- 13mo,l 在GPGE 圖譜上, SOD濃度為1.56 10- 14mo l時譜帶清晰, 當(dāng)再稀釋10倍后仍能見到SOD 譜帶(圖片未列出) , 說明PAGE 和GPGE 檢測SOD的靈敏度分別為156 10- 13mo l和1.56 10- 15mo.l 在GPGE 圖譜中牛血SOD活性染色與蛋白染色帶邊緣清晰, 呈扁平狀, 在1.56 10- 12mol SOD 時活性染色帶可分辨出1條主帶和2條次帶及1條弱帶(圖2中A 3) , 與6.24 10- 9mo l SOD時的蛋白帶相互對應(yīng)(圖2中B5); 而在同樣加樣量下的PAGE 圖譜中譜帶邊緣模糊, 只能分辨出1條主帶和1條次帶(圖2中C10). 說明GPGE 比PAGE 有更高的分辨率.
花生SOD粗酶液( 125 U /mL)分別以1 ??L進(jìn)行GPGE 和PAGE 時, 在GPGE 圖譜上Mn??SOD和CuZn??SOD譜帶非常清晰(圖2的13) , 但在PAGE圖譜上已無明顯的譜帶(圖2的19) . 花生CuZn-SOD 在GPGE中分別加樣0.016 g和0.128 g, 在PAGE 中分別加樣0.032 g和0.32 g時, 低、高濃度SOD譜帶掃描后峰面積之比分別為1??3??37和1??1??54. 從圖1和圖4還能看出南苜蓿、番茄、金蕎麥等在梯度膠上顯示出4~ 5條帶, 但PAGE圖譜上顯示2~ 3條. 純化的枸杞Fe??SOD有3條帶, 但在GPGE 上的靈敏度和分辨率明顯高于PAGE(圖3的4, 9) . 可見, 對于植物的粗酶液和純酶, GPGE 同樣比PAGE 有較高的靈敏度和分辨率.
2.3 不同膠濃度對3種SOD類型分離和鑒定的影響
枸杞和香櫞都含有3種類型SOD, 它們在不同膠濃度下的分離結(jié)果見圖3. 枸杞在7-5% PAGE 中有3條Fe-SOD, 它們的Rf 最大, CuZn-SOD也有3條, 它們的Rf 居中, Mn-SOD 不成條帶, 很難確定. 在10%的PAGE 中3條Fe-SOD 帶上移已與第三條CuZn-SOD 相重疊, Mn-SOD 帶已能基本分清. 同時可見在7-5%和10%的PAGE 中還存在CuZn-SOD 抑制不完全的現(xiàn)象, 經(jīng)KCN和H2O2 處理后在負(fù)極處的一些譜帶性質(zhì)也很難判斷; 在4% ~ 35% 的梯度膠中3種類型SOD 譜帶完全分離, Fe-SOD 帶上移至Mn-SOD和CuZn-SOD間, 與純化的Fe-SOD 有相同的Rf值. 香櫞SOD 在10% 的PAGE 中, 有1條對KCN 和H2O2 都敏感的CuZn-SOD譜帶, 它的Rf 值最小, Mn-SOD和Fe-SOD 即使以抑制劑處理, 也因未分離開和分辨率差無法判斷. 在4% ~ 35%的梯度膠中3種SOD 同工酶都有規(guī)律地完全分開, Rf 值最小的1條為Mn-SOD, Rf值較大的2條為CuZn-SOD, Rf值位于兩者之間的為Fe-SOD.
可見, 枸杞和香櫞的3 種SOD 類型, 它們在7??5% 和10% 的PAGE 中分離難有規(guī)律可循, 如香櫞CuZn-SOD的Rf 值在同工酶中最小(圖3D) , 同為Fe??SOD, 在枸杞中的Rf 值最大(圖3A ), 在朱桔中Rf 值卻最小(圖5A ). 當(dāng)用KCN 和H2O2 鑒定SOD 類型時, 常有抑制不完全的現(xiàn)象, 有的因譜帶重疊, 即使采用抑制劑也很難有結(jié)果, 如香櫞的Fe-SOD、Mn-SOD(圖3D )和朱桔的Mn-SOD、CuZn-SOD (圖5A ) . 但在4%~ 35% 梯度膠上, 如存在Fe-SOD時, 其Rf 值總是位于Mn-SOD 和CuZn-SOD 之間, 枸杞、香櫞和朱桔3種類型SOD 在梯度膠上均有此規(guī)律可尋. 在梯度膠中以其Rf 值大小判斷SOD 的類型的結(jié)果與用抑制劑處理的結(jié)果完全一致, 利用這一特點我們發(fā)現(xiàn)了許多高等植物含有Fe-SOD，
2.4 SDS處理對在GPGE和PAGE 中SOD類型鑒定的影響
樣品經(jīng)1% SDS處理后, 以相同量分別進(jìn)行GPGE 和PAGE, 結(jié)果見圖4. 在梯度膠中, 7種植物在A區(qū)的SOD 譜帶活性都被SDS抑制, 無一例外, 表明它們都是Mn-SOD; C 區(qū)的SOD 譜帶對SDS不敏感, 為CuZn-SOD, 其中金蕎麥和還亮草都含有1條對SDS敏感的譜帶, 但它們經(jīng)KCN 和H2O2 處理譜帶消失, 具有CuZn-SOD的典型特征, 這些譜帶的Rf 值在經(jīng)SDS 處理前后一致. B 區(qū)帶中被SDS 抑制的為Fe-SOD,其中代代花和南苜蓿的Fe??SOD的含量大于30% , 金蕎麥、馬兜鈴、無花果、三葉草都含有對SDS 敏感的Fe-SOD(結(jié)果待發(fā)表). 經(jīng)SDS處理后留存的為CuZn-SOD, 而Mn-SOD 和Fe-SOD 譜帶消失, Mn-SOD 和Fe-SOD的區(qū)分則可根據(jù)它們在GPGE 圖譜上的Rf值確定. 由此可見, GPGE 結(jié)合SDS處理是SOD類型鑒
定的有效途徑之一.
在PAGE 圖譜上經(jīng)SDS處理后, 有的譜帶活性基本不變, 如2、6和12, 有的出現(xiàn)了一些新譜帶, 如37、9、13、15, 可能是CuZn-SOD 與Mn-SOD、Fe-SOD 重疊所致或是經(jīng)SDS處理改變了SOD 電荷性質(zhì). 番茄在梯度膠B 區(qū)有2條對SDS敏感的SOD 譜帶(圖4中17), 證實了它存在Fe-SOD , 但在PAGE 上經(jīng)SDS處理后未發(fā)現(xiàn)Fe-SOD, 顯然在PAGE 中經(jīng)SDS處理不適合于植物粗提液中SOD類型判定.
2.5 SOD譜帶在GPGE和PAGE 中的相互關(guān)系
結(jié)果見圖5. 朱桔在二次電泳(圖5C)中的a、b帶對應(yīng)于GPGE圖譜上的a、b帶(圖5B )和PAGE 圖譜上的a、b帶(圖5A ) , 分別為Mn-SOD 和Fe-SOD, 但在PAGE圖譜上a帶Rf 值大于b帶; c帶有2條為CuZn-SOD, 在二次電泳和梯度膠中是相互對應(yīng), 但在PAGE 圖譜上a、c帶混雜, 從純化的Mn-SOD 和CuZn-SOD 的PAGE 圖譜上可看出a、c是重疊帶. 在二次電泳中新、老葉中Fe-SOD活性都約占SOD 總活性的30%, 與GPGE 中的結(jié)果相當(dāng), 但在PAGE 中老葉這一比例約30% , 新葉低于5%.
從二次電泳中SOD 譜帶在PAGE 和GPGE 中的對應(yīng)關(guān)系可看出, 朱桔3種SOD 類型在GPGE中能按照分子大小有效地分離和鑒別, 但在PAGE 中SOD譜帶有重疊現(xiàn)象, 分離不徹底, 新葉中的植物次生物質(zhì)干擾了SOD活性顯示, 甚至無譜帶.
3 討論
目前國內(nèi)外在SOD同工酶的分離和鑒定研究中都是采用10%左右的PAGE, 但分離效果和圖譜都不很理想. 我們在枸杞果實SOD 研究中采用了GPGE, 并首次報道了枸杞含有Fe-SOD , 在隨后的研究中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了何首烏、香櫞等十幾種高等植物存在Fe-SOD . 迄今為止國內(nèi)外報道含F(xiàn)e-SOD 的高等植物僅
番茄、銀杏、睡蓮、蕓苔、樟樹等十幾種 , SOD 同工酶的分離也都是采用PAGE, 我們的發(fā)現(xiàn)與用
GPGE 替代PAGE 研究SOD 電泳技術(shù)改進(jìn)密切相關(guān), 但對GPGE 分離和鑒定SOD 類型和SOD 譜帶在GPGE 與PAGE中相互對應(yīng)關(guān)系的研究國內(nèi)外尚未見報道, 本文對此進(jìn)行了初步探討.
3.1 GPGE 比PAGE能更有效地分離和鑒定SOD同工酶類型本研究表明, 在GPGE圖譜上的SOD 譜帶可明顯分為A、B、C 3個區(qū), A 區(qū)Rf 值最小, 對SDS敏感, 為分子量最大的Mn-SOD; C區(qū)Rf值最大, 對SDS不敏感, 為相對分子質(zhì)量較小的CuZn-SOD; B區(qū)的譜帶Rf值位于二者之間, 經(jīng)SDS處理后消失, 為Fe-SOD. 由于GPGE 是根據(jù)孔徑大小分離酶和蛋白質(zhì), 其Rf 值與SOD分子大小有相關(guān)性 , 使酶的分離和鑒定變得相對容易和簡單化, 當(dāng)結(jié)合SDS處理時能將CuZn-SOD
和Mn-SOD、Fe-SOD區(qū)分開, 由于Fe-SOD 的Rf值通常位于Mn-SOD 和CuZn-SOD間, 故可確定SOD 類型.
本文中枸杞、朱桔、香櫞存在的3種SOD 類型符合這一規(guī)律, 當(dāng)采用KCN 和H2O2 對枸杞、香櫞、金蕎麥和還亮草等SOD類型進(jìn)行鑒定時, 結(jié)果與GPGE 中各譜帶Rf 值與SDS 處理相結(jié)合來確定酶類型的結(jié)果一致, 說明了將GPGE 中各譜帶Rf 值與SDS處理的結(jié)果相結(jié)合是分離和鑒定SOD類型的一種簡便有效的新方法. 在傳統(tǒng)的PAGE 中SOD 譜帶受其所帶電荷、分子大小、膠濃度等多種因素影響, 分離的Rf 值變化較大, 如本文中Fe??SOD 的Rf 值在枸杞中最大, 在朱桔中最小, Rf 值與SOD 類型及分子大小間無特定規(guī)律可尋, 鑒定SOD 類型要采用KCN 和H2O2 等抑制劑, 由于KCN為劇毒品, 使SOD類型的研究受到了限制,當(dāng)酶帶相互重疊時甚至無法有結(jié)果(如香櫞、朱桔等) . 可見, 在SOD分離和類型鑒定方面GPGE 比PAGE有更大的優(yōu)勢和應(yīng)用前景.
3??2?? GPGE 分離SOD的靈敏度和分辨率
本文對GPGE 和PAGE檢測SOD 的靈敏度和分辨率進(jìn)行了比較, 結(jié)果表明, PAGE 檢測牛血SOD靈敏度為10- 13mo ,l GPGE檢測牛血SOD 靈敏度可達(dá)10- 15 mo.l 由于GPGE 的靈敏度比PAGE 高2個數(shù)量級, 可檢測到在PAGE 圖譜上因含量很低難以顯示或活性低于5% 的Fe??SOD 譜帶(如馬兜鈴、無花果三葉草等) , 它們的Rf值都位于Mn??SOD和CuZn??SOD的B 區(qū)之間. 在GPGE 圖譜中SOD 譜帶清晰, 點樣量適中時為扁平形, 邊緣明顯, 有較高的分辨率, 牛血SOD可清晰辨認(rèn)出4條帶, 番茄和朱桔粗酶液可分辨出4~ 5條帶, 在PAGE圖譜中因干擾的存在大大影響了譜帶的分辨, 它們的譜帶較模糊只有2~ 3條. 純化的枸杞Fe-SOD在GPGE 和PAGE 中都有3條帶, 但前者的靈敏度和分辨率明顯高于后者. 高的靈敏度和分辨率使實驗結(jié)果更準(zhǔn)確可靠, 可見, GPGE 分離SOD特別是Fe-SOD 是比PAGE 更好的方法.
3.3 GPGE 分離和鑒定SOD的可靠性
本文發(fā)現(xiàn)在C區(qū)對SDS敏感的譜帶(金蕎麥和還亮草)也能被KCN 和H2O2 抑制為CuZn-SOD, 說明了以Rf 值來判斷SOD類型是可靠的. 植物材料中的次生物質(zhì)豐富, 它們會與SOD結(jié)合影響酶顯示 , 朱桔Fe-SOD(新葉)和何首烏Mn-SOD (圖片未列出)在PAGE 中幾乎無帶, 在GPGE 中含量都達(dá)30%左右,與二次電泳結(jié)果一致, 提示在GPGE 中經(jīng)長時間電泳后干擾物可能與SOD 分離泳出凝膠, 能真實反映出全部SOD 譜帶, 而PAGE會造成一些SOD的漏檢. SOD譜帶在GPGE 和PAGE 中對應(yīng)關(guān)系由二次電泳反映出來, GPGE中的SOD 譜帶通過二次電泳都能和PAGE 的相互對應(yīng), 說明了GPGE 分離和鑒定SOD的結(jié)果是可靠的, 但PAGE 中3種SOD 類型的Rf 值變化很大, 與酶類型間無相關(guān)性, 同時, 通過二次電泳還可以看出, GPGE 對在PAGE 上重疊和有干擾的SOD譜帶的分離和鑒定是有效的.
GPGE 在分離和鑒定SOD方面有諸多優(yōu)勢, 但對研究帶有不同電荷的同一類型SOD同工酶, 則PAGE會更好地反映出同工酶間的差異, 可見, 將GPGE 和PAGE 相結(jié)合研究植物SOD同工酶是更科學(xué)的方法.
