在馬鈴薯的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，晚疫病是影響其生長發(fā)育的重要病害。它是由致病疫霉菌引起的，當(dāng)溫度和濕度達(dá)到一定條件后，在大田中會迅速傳播，被侵染的植株會成片凋亡。SSR( simple sequence repeat) 標(biāo)記是一種新型的、簡單快速的分子標(biāo)記方法，在研究群體遺傳結(jié)構(gòu)方面具有明顯的優(yōu)勢。因此，應(yīng)用該技術(shù)開展的相關(guān)科研工作也非常多，在真菌、卵菌、植物和動物上都有研究報道。其最突出的特點是結(jié)果穩(wěn)定性好，具有高多態(tài)性和呈共顯性，目前已經(jīng)有很多適用于致病疫霉的SSR 標(biāo)記被開發(fā)。

聚丙烯酰胺凝膠電泳( PAGE) 技術(shù)一種被普遍適用的分子檢測技術(shù)，其特點是檢測靈敏度和分辨率都比較高，并且操作方法簡單、試驗時間短，對樣品需求量少，在RAPD、AFLP、SSR 等分子標(biāo)記中經(jīng)常會用到。筆者以2009 年在寧夏固原及周邊地區(qū)采集分離得到的73 個致病疫霉菌為材料進(jìn)行SSR 分析，總結(jié)了試驗中PAGE 凝膠電泳和銀染技術(shù)的一些經(jīng)驗，建立了一種快速、簡便的適用于致病疫霉菌SSR 標(biāo)記的電泳和染色技術(shù)方法。

1 材料與方法

1． 1 供試材料于2009 年9 月，在寧夏固原地區(qū)采集馬鈴薯晚疫病菌菌株樣品，實驗室分離純化得到73 個致病疫霉菌分離物。SSR 引物由金斯瑞公司合成。主要生化試劑，如Marker、酶、dNTPs、丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺等均購自大連生物工程公司。

1． 2 DNA 提取基因組DNA 的提取采用西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室改良的玻璃珠振蕩粗提法，具體方法參照李海娟等人的方法。DNA 的保存用TE( Tris-EDTA)緩沖液，置于-20 ℃的冰箱內(nèi)保存。

1． 3 PCR 擴(kuò)增用8 對在基因組中互不連鎖的SSR 引物PI02、PI4B、PI63、SSR4、SSR8、SSR11、G11、D13 對基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 基本反應(yīng)程序: 94 ℃變性2 min; 94 ℃變性30 s， 66 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，共13 個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低1 ℃; 94 ℃變性30 s 秒， 53 ℃退火30 s， 72℃延伸30 s，共28 個循環(huán); 72 ℃延伸2 min; 10 ℃保存。引物D13 的退火溫度為60 ℃，引物G11 的退火溫度為64 ℃，其他條件一致。

1． 4 PAGE 試驗采用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴(kuò)增的SSR 片段。不同大小的片段經(jīng)過多次試驗，使用8%和12% 2 種不同濃度的凝膠進(jìn)行電泳分離。聚丙烯胺凝膠的配制方法如表1 所示。

電泳操作步驟: ①組裝制膠器; ②用移液槍將配制好的醛溶液300 μl 加入到300 ml 1. 5%氫氧化鈉溶液中待用。

1． 5． 2 染色步驟。染色( 搖床，0.1%硝酸銀溶液，一般不超過20 min) →蒸餾水洗2 次→顯色( 搖床，加入甲醛的1. 5%氫氧化鈉溶液，至條帶清晰即可) →終止→蒸餾水洗2 次→照相。

2 結(jié)果與分析

2． 1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果用8 對在基因組中互不連鎖的SSR引物對基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物目的片段大小如表2所示。

試驗結(jié)果表明，采用12% 聚丙烯凝膠電泳檢測引物D13、G11，8%聚丙烯凝膠電泳檢測引物PI4B、PI63、SSR4。用這2 種濃度的凝膠進(jìn)行檢測取得了比較理想的電泳及染色效果。

由此可見，此種方法檢測馬鈴薯晚疫病原菌SSR 標(biāo)記，取得了良好的效果。這樣大大縮短了試驗時間，并且簡化了試驗步驟，檢測靈敏度高、操作簡單、獲得的條帶清晰等特點，這是一種行之有效、簡便快捷的檢測方法。

3 討論

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段檢測可采用瓊脂糖電泳法，也可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法。瓊脂糖電泳的分辨率較低，不能滿足該試驗中所用的8 個引物擴(kuò)增片段檢測的要求。

使用PAGE 進(jìn)行檢測時，通常需要根據(jù)分離的DNA 片段大小配制不同濃度的凝膠，一般在3． 5% ～ 20． 0%。而該試驗摸索出的針對致病疫霉菌的聚丙烯酰胺凝膠電泳的條件以及銀染方法操作過程簡單，試驗時間大大縮短，可為開展致病疫霉菌的群體遺傳方面的研究提供便利。

染色方法實驗室通常使用EB 染色或銀染。用EB 染色，靈敏度低，染色效果不好，得到的條帶模糊、暗淡。而EB 本身有毒，并對環(huán)境會造成污染。該試驗采取了銀染的方法，筆者將染色的操作方法作了改進(jìn)。改進(jìn)后的方法縮短了銀染的時間，操作程序簡單、靈敏度高、染色液容易保存，大大簡化了實驗步驟。

另外，凝膠的濃度和電泳時間是影響試驗結(jié)果的重要的參數(shù)。試驗結(jié)果表明，在聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8%、電泳電壓為200 V 的情況下，電泳1. 5 h，在聚丙烯酰胺凝膠的濃度為12%、電泳電壓為200 V 的情況下，電泳2 h，PCR產(chǎn)物多態(tài)性條帶清晰、明亮、穩(wěn)定，為分析數(shù)據(jù)提供有利證據(jù)。