建立用熒光分光光度計測定總抗氧化能力的方法。方法：以2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)作為過氧自由基來源，sodium fluorescein(FL)為熒光指示劑，水溶性VE(trolox)為定量標(biāo)準(zhǔn)，熒光值半數(shù)衰減時間作為觀察指標(biāo)，測定6 種保健食品的總抗氧化能力。結(jié)果：方法的最低檢測限為0.22μmol/L，線性回歸方程Y=25.432X+2.0625，R2=0.9949，平行性精密度(RSD)3.5%，重復(fù)性精密度(RSD)3.9%，加標(biāo)回收率在90%～104% 之間。結(jié)論：用熒光分光光度計可以測定保健食品總抗氧化能力。

關(guān)鍵詞：食品檢測；總抗氧化能力；熒光分光光度法

生物活性物質(zhì)總抗氧化能力是物質(zhì)清除不同自由基或物質(zhì)的不同活性成分清除不同自由基的有效和，鑒于抗氧化活性物質(zhì)在機體內(nèi)起作用的正是其總的抗氧化能力，因此可用總抗氧化能力(total antioxidant activity，TAA)來評價生物活性物質(zhì)的抗氧化功能[1-5]。氧自由基吸收能力法(oxygen radical absorbancecapacity，ORAC)是近年來由Cao 等[6-7]在Glazer[8]研究基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種總抗氧化能力測定方法。它是基于H 原子轉(zhuǎn)移機制(HAT)的一種方法，其與生理相關(guān)性高于基于電子轉(zhuǎn)移(SET)機制的方法[9]，可以通過改變自由基和反應(yīng)體系的溶劑，測定脂溶性和水溶性物質(zhì)的抗氧化活性[10-14]。實驗以2,2’- 偶氮二(2- 脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)作為過氧自由基來源，其與抗氧化劑的摩爾比非常高，使得方法專一性強[15-16]。方法中使用的熒光素(FL)不與待測樣品發(fā)生作用，不會干擾樣品的測定結(jié)果，因此對抗氧化劑測定具有特異性。

ORAC 法使用自動熒光酶標(biāo)儀作為測定儀器，由于該機器價格昂貴，限制了該方法的普及。與之相比，熒光分光光度計價格低廉、應(yīng)用廣泛，因此有必要研究用熒光分光光度測定天然產(chǎn)物及保健食品總抗氧化能力的方法。

材料與方法

1.1 材料與試劑

脂益康粉、蟲草粉、紅曲粉、山竹粉、茄紅素營養(yǎng)膠囊、景天養(yǎng)身膠囊均購于同仁堂藥店。熒光素(FL)、VE 水溶性類似物(trolox) Acros 公司；2,2’- 偶氮二(2- 脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH) 美國J&K Chemica 公司；VC、環(huán)己烷、二甲亞砜、三水磷酸氫二鉀、二水磷酸二氫鈉(以上試劑均為分析純) 北京化工廠；去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

RF-5301 PC 熒光分光光度計日本島津公司；TDL-5-A 型臺式離心機上海安亭科學(xué)儀器廠；BF211D 電子天平北京賽多利斯天平有限公司；SHB- Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；移液器德國艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 ORAC 法原理

使用FL 為氧化底物，AAPH 為自由基產(chǎn)生劑。FL在有自由基作用下被氧化，熒光強度逐漸減弱；當(dāng)有抗氧化劑存在時，熒光強度減弱被抑制，且抗氧化劑對FL 熒光強度的保護能力與其濃度呈正比。以抗氧化劑Trolox 作為標(biāo)準(zhǔn)，用來定量樣品的抗氧化能力。

1.3.2 檢測波長的選擇

分別移取FL使用液0.3mL和75mmol/L磷酸鹽緩沖液2.7mL，置于一潔凈干燥試管中，充分混合后用熒光分光光度計掃描吸收和發(fā)射光譜圖，確定最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長。

1.3.3 AAPH 用量選擇及在系統(tǒng)中釋放過氧自由基穩(wěn)定性觀察用量選擇：AAPH 不穩(wěn)定，易受pH 值、溫度等因素的影響，需要現(xiàn)用現(xiàn)配，每次開展新實驗前，要重新確定其最佳用量，確定原則為FL 熒光值半數(shù)衰減時間在5～15min 為宜。AAPH 釋放過氧自由基的穩(wěn)定性觀察：在相對恒溫的環(huán)境下，用熒光半數(shù)衰減時間指標(biāo)對AAPH 釋放過氧自由基的穩(wěn)定性進行觀察。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及方法可靠性分析

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取Trolox 儲備液(終濃度10μmol/L)加磷酸鹽緩沖液依次稀釋成濃度5.000、2.500、1.250、0.625、0.312、0.156μmol/L 五個Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液。另設(shè)一支自由基對照(+AAPH)管、一只空白對照(-AAPH)管。各管分別加入終濃度63nmol/L FL 使用液0.3mL，標(biāo)準(zhǔn)管加入75mmol/mL磷酸鹽緩沖液0.3mL，五個濃度的Trolox 0.3mL，(+AAPH)管、(-AAPH)管分別加入75mmol/mL 磷酸鹽緩沖液0.6mL 和2.7mL，混勻，除(-AAPH)管外，其他各管分別加入終濃度4mmol/L AAPH 2.1mL，充分混勻，并開始計時。以熒光半數(shù)衰減時間作為縱坐標(biāo)、Trolox 濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光半數(shù)衰減時間的記錄方法：以(-AAPH)管的熒光值為一個單位，當(dāng)熒光值降低到0.5 個單位時所用的時間即熒光半數(shù)衰減時間。

1.3.4.2 最低檢測限下限

連續(xù)測定空白(+AAPH)熒光半數(shù)衰減時間8 次，最低檢測限=3s /K。式中，s 為標(biāo)準(zhǔn)偏差；K 為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.3.4.3 平行性精密度實驗

準(zhǔn)確稱取0.01g 山竹粉5 份，分別測定總抗氧化能力并計算ORAC 值及RSD 值。具體方法如下：0.01g 山竹粉加入3mL環(huán)己烷和3mL 75mmol/L磷酸鹽緩沖液，充分