檢測波長

設定激發(fā)波長為48 5nm，掃描發(fā)射波長，最大發(fā)射光譜峰在512nm(圖1)。設定發(fā)射波長為512nm，掃描激發(fā)波長，最大激發(fā)光譜峰在491nm(圖2)。因此，確定最佳激發(fā)、發(fā)射波長分別為491nm 和512nm。試劑用量與AAPH 在系統(tǒng)中釋放過氧自由基穩(wěn)定性觀察FL 熒光值在AAPH 作用下衰減速度不宜過快。過快，樣品的熒光半數(shù)衰減時間不容易拉開，靈敏度會降低。但也不宜過慢而導致實驗時間增加。經(jīng)反復測試，在本實驗室條件下，AAPH 溶液終濃度4mmol/L 時FL 熒光衰減速度適宜。

AAPH 釋放過氧自由基的速度具有一定的波動性，由圖3 可知，在試劑配制4h 以后，熒光半數(shù)衰減時間出現(xiàn)上升趨勢，說明過氧自由基釋放速度有所減緩。

標準曲線及方法可靠性分析

2.3.1 Trolox 標準曲線制作

實驗結果表明，熒光半數(shù)衰減時間與Trolox 濃度有良好線性關系，線性方程為Y=25.43X ＋ 2.062，線性相關系數(shù)為0.9949方法可靠性分析

2.3.2.1 最低檢測下限

表1 結果表明，該方法最低檢測限為0.22μmol/L。通過幾種保健食品的總抗氧化能力測定，其數(shù)值在102～103μmol/g，所以此方法完全可以滿足測定需要。

2.3.2.2 平行性精密度實驗

表2 結果表明，方法平行性精密度為3.5%，說明該方法的平行精密度良好，測定結果較滿意。

2.3.2.3 重復性精密度實驗

表3 結果表明，方法重復性精密度為3.9%，說明該方法的重復性良好，測定條件易控制，測定結果較滿意。

表4 結果表明，加標回收率范圍為90%～104%，與熒光酶標儀測定總抗氧化能力的加標回收率相差不大[11]，回收率結果比較好，說明本測量方法的誤差較小，可以作為本實驗的測定方法。

2.4 測定保健品總抗氧化能力

綜合考慮保健食品脂溶性部分和水溶性部分抗氧化能力，作為保健食品的總抗氧化能力。6 種保健食品均準確稱取0.01g。為了保證在工作曲線內(nèi)測定，用75mmol/L磷酸鹽緩沖液對提取液進行不同倍數(shù)的稀釋。測定結果見表5 。表5 結果表明，紅曲、山竹、景天養(yǎng)身水溶部分抗氧化能力優(yōu)于脂溶部分；蕃紅素、蟲草、脂益康脂溶部分抗氧化能力優(yōu)于水溶部分。

3 討 論

ORAC 法是基于HAT 機制的方法，與經(jīng)典的脂質過氧化的方法類似，最接近生理真實的氧化過程。因此，ORAC 法應用在保健食品抗氧化能力檢測具有重要意義，它既可以直接檢測保健食品的總抗氧化能力，其中脂溶性和水溶性兩部分抗氧化能力可以分別評價；也可以測定攝入保健食品前后動物血液或臟器總抗氧化能力，并根據(jù)其變化情況，進行兩者相關性研究，為保健食品的研發(fā)提供重要依據(jù)。ORAC 法在我國開展的并不普遍，主要原因是受到了儀器設備的限制。本實驗用熒光分光光度計替代全自動熒光酶標儀，用熒光半數(shù)衰減時間替代熒光衰退曲線下面積，建立了新的實驗方法。首先確定了熒光分光光度計的最佳激發(fā)、發(fā)射波長分別為491nm 和512nm。由于ORAC 法是由FL、AAPH 和抗氧化劑(樣品或標準Trolox)組成的一個三元結構的實驗體系。FL 的熒光非常穩(wěn)定，AAPH 產(chǎn)生的過氧自由基能夠使FL 氧化導致熒光衰退，抗氧化劑捕捉自由基保護FL 不被氧化，同時其不與FL 反應，不會影響FL 的熒光值，因此實驗標準曲線線性的好壞以及方法可靠性的關鍵在于AAPH 釋放過氧自由基的穩(wěn)定性。實驗發(fā)現(xiàn)，AAPH 釋放過氧自由基具有一定的波動性，試劑放置4h 以上，自由基釋放速度有下降趨勢。因此，在測定樣品同時要帶一個標準和空白(+AAPH)。用熒光分光光度計測定熒光衰退曲線下面積費時費力。測定一個樣品需要間隔2min 測一個數(shù)據(jù)，連續(xù)測定120min。如果能用熒光半數(shù)衰減時間替代熒光衰退曲線下面積，則只需要測定2 個數(shù)據(jù)，時間約為40min。從圖4 可以看到熒光半數(shù)衰減時間與Trolox 濃度有良好線性關系，線性方程為Y=25.43X+2.062，線性相關系數(shù)為0.9949。本實驗在研究中用熒光衰退曲線下面積為觀察指標進行測定，其與Trolox 濃度的線性方程為Y=26.03X － 0.2578，線性相關系數(shù)為0.9941。說明完全可以用熒光半數(shù)衰減時間替代熒光衰退曲線下面積作為抗氧化能力的觀察指標。

標準曲線及方法可靠性分析顯示：方法的最低檢測限為0.22μmol/L、線性回歸方程Y=25.43X+2.062，R2=0.9949、平行性精密度RSD=3.5%、重復性精密度RSD為3.9%、加標回收率在90%～104% 之間，說明用熒光分光光度計可以測定保健食品總抗氧化能力。