大蒜素亞微乳注射液的制備

稱取蛋黃卵磷脂1??0 g, 維生素E 0??2 g, 注射用大豆油3??0 g和注射用中鏈油3??0 g混合后, 加熱并不斷攪拌至溶液全部澄清, 加入大蒜素原料

1??5 g使之全部溶解作為油相; 再稱取甘油2??5 g溶解于適量注射用水中, 于適宜溫度攪拌后加至上述油相混合物中, 形成初乳, 加適量氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH 至6??0, 補(bǔ)加注射用水至100 mL, 混勻, 經(jīng)高壓乳勻機(jī)精乳化3次, 并以0??22 ??m 微孔濾膜過濾除菌, 最后無菌灌封至2mL安瓿瓶中, 即得大蒜素亞微乳注射液。

2??2?? 大蒜素亞微乳體內(nèi)外含量測定方法的建立

2??2??1?? 色譜條件?? 色譜柱: C18 ( 4??6 mm ?? 250mm, 5 ??m) ; 流動相: 甲醇??水??甲酸( 87??13??0??1), 檢測波長: 220 nm, 柱溫: 35 ?? , 流速: 1??0 mL /m in。

2??2??2?? 制劑的含量測定?? 精密量取本品適量(約相當(dāng)于大蒜素7??5mg), 置100mL量瓶中, 加甲醇溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 超聲10m in, 作為供試品溶液;另精密稱取大蒜素對照品適量, 加甲醇溶解并稀釋制成每毫升中約含75 mg 大蒜素的溶液, 作為對照品溶液。精密量取供試品溶液與對照品溶液各20 ??L注入液相色譜儀, 記錄色譜圖, 按外標(biāo)法以峰面積計算。經(jīng)測定, 大蒜素亞微乳中大蒜素的含量為15mg /mL, 樣品標(biāo)示量為100??5% 。在本色譜條件下, 各輔料不影響大蒜素的測定, 專屬性良好, 在25??5~ 127??5 ??g /mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 線性方程為A = 29 626c + 36 251( r = 0??999 7), 精密度、回收率及溶液穩(wěn)定性均符合要求。

2??3?? 大蒜素亞微乳注射液的質(zhì)量評價

2??3??1?? 大蒜素亞微乳的外觀性狀及微觀形態(tài)?? 本品外觀性狀為白色乳狀液體, 略帶黏性, 略有特異性蒜臭味。將大蒜素亞微乳注射液以磷酸鹽緩沖液稀釋10倍, 滴于銅網(wǎng)上, 1% 磷鎢酸染色, 負(fù)染30m in, 干燥后用透射電鏡(TEM )觀察。通過透射電鏡觀察到制備的大蒜素亞微乳注射液為大小均勻的球形或橢球形粒子, 如圖2所示。

2??3??2?? 大蒜素亞微乳的粒徑分布?? 取本品1支,精密吸取其中0??1 mL, 用純化水分別稀釋至100倍, 混勻, 作為供試液, 用動態(tài)激光散射粒徑測定儀測定。測得的大蒜素亞微乳注射液的平均光強(qiáng)徑為152??9 nm; 體積徑為115??7 nm, 所得制劑粒徑較小、分布均勻、分布范圍較窄。

2??3??3?? 大蒜素亞微乳注射液的包封率測定?? 采用超濾離心法測包封率, 將超濾離心管(截留相對分子質(zhì)量8 000~ 10 000)用注射用水洗去甘油, 精密吸取本品250 ??L, 加入超濾離心管中, 離心( 10 000r /m in) 30 m in。取出全部濾出液, 按上述含量測定方法計算游離的大蒜素含量; 同時精密吸取超濾離心前的樣品, 計算溶液中大蒜素的總?cè)苜|(zhì)量; 計算大蒜素亞微乳樣品的包封率為96??5%。

2??3??4?? 穩(wěn)定性試驗

配伍穩(wěn)定性試驗?? 取大蒜素亞微乳注射液5mL, 按臨床用法分別加入到5% 葡萄糖注射液或0??9%氯化鈉注射液250 mL中, 分別在第0, 0??5,2, 6小時吸取稀釋液, 考察其含量、pH 及平均粒徑的變化。測定結(jié)果如表1。結(jié)果表明, 0??9% 氯化鈉注射液對本品的穩(wěn)定性優(yōu)于5%的葡萄糖注射液, 葡萄糖注射液配伍6h后有較大乳粒。影響因素試驗?? 以大蒜素亞微乳的外觀、pH、粒徑、含量、有關(guān)物質(zhì)、包封率為指標(biāo), 考察其在高溫( 60 ?? 2) ?? 、( 40 ?? 2) ?? , 低溫4 ~ 8 ?? 、光照條件下, 放置5, 10 d的穩(wěn)定性, 另外將樣品冷凍放置24 h, 再室溫放置24 h, 作為一次凍融循環(huán), 于第3次循環(huán)完成后取樣, 考察各項指標(biāo)。結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明, 本品在60 ?? 高溫條件下放置5 d,含量下降均超過5%, 乳滴平均粒徑稍有增大, 所以不再進(jìn)行10 d的考察; 在低溫( 4~ 8 ?? )下, 各項指標(biāo)均無明顯變化。光照條件下部分藥物降解,含量下降顯著, 包封率隨溫度和光照強(qiáng)度的增強(qiáng)而降低凍融循環(huán)3 次后粒徑增幅較大, 有破乳現(xiàn)象, 包封率下降較快。綜上所述, 本品在此包裝條件下, 宜在遮光, 密封, 陰涼處貯存, 不宜冷凍保存。加速和長期穩(wěn)定性試驗?? 以大蒜素亞微乳的外觀、粒徑、pH、含量、有關(guān)物質(zhì)為指標(biāo), 考察樣品加速及長期試驗6個月的樣品穩(wěn)定性。加速試驗條件為25 ?? 下避光放置6個月, 分別于0, 1, 2, 3,6月取樣, 長期試驗條件為20 ?? 下避光放置12個月, 分別于0, 3, 6, 9, 12個月取樣測定。測定結(jié)果如表3。

加速試驗結(jié)果表明, 本品在模擬上市包裝的條件下, 在( 25 ?? 2) ?? 條件下放置6個月, 亞微乳劑外觀性狀沒有破乳、分層等現(xiàn)象, 含量稍有下降, 有

關(guān)物質(zhì)含量略有升高, 乳滴的平均粒徑有所增大,但均在限度范圍內(nèi), 其他各項質(zhì)量指標(biāo)均未見明顯改變, 說明本品在此包裝條件下物理及化學(xué)穩(wěn)定性較好。長期試驗結(jié)果表明, 在模擬上市包裝條件下,經(jīng)( 20 ?? 2) ?? 、遮光, 密封條件下貯存留樣12個月試驗考察, 各項指標(biāo)無明顯變化, 說明本品在此包裝條件下12個月內(nèi)物理及化學(xué)穩(wěn)定性較好, 此項實驗仍在進(jìn)行中。

2??3??5?? 大蒜素亞微乳注射液的刺激性考察?? 取家兔8只, 雌雄各半, 平均分成兩組, 采用同體左右耳自身對比法進(jìn)行試驗。一組給予大蒜素注射液

(乳劑)的供試品溶液, 另外一組給予大蒜素注射液(市售)的供試品溶液作為對照組, 兩組家兔每只分別右耳靜脈緩慢滴注供試品溶液1??2 mg /kg(給藥容積為5mL /kg) , 左耳靜脈注射等容積的滅菌5%葡萄糖注射液, 每日1次, 連續(xù)3日; 每日肉眼觀察動物一般狀況、行為、體征及給藥局部反應(yīng)

(顏色、紅斑、水腫、充血程度及范圍), 末次給藥后48 h, 處死動物, 分別剪取雙耳注射處耳靜脈及周圍組織約5 cm, 肉眼觀察有無紅腫、水腫、丘斑形成, 并用10%的甲醛固定后, 石蠟切片, HE 染色,顯微鏡下觀察其炎性細(xì)胞浸潤、血管周圍組織出血、血栓形成及壞死等情況, 并判斷血管刺激性反應(yīng)程度。

結(jié)果表明, 給藥期間動物的一般狀況、行為及活動正常。大蒜素注射液(乳劑)連續(xù)給藥3 d, 肉眼觀察家兔耳靜脈血管及周圍組織, 未見紅腫、充

血等異常現(xiàn)象。顯微鏡觀察, 5% 葡萄糖注射液組和大蒜素注射液(乳劑)組血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管腔及周圍組織在距注射部位1 cm和5 cm 處均未見

異常; 血管周圍組織未見炎性細(xì)胞浸潤及壞死; 管腔內(nèi)無血栓形成。而大蒜素注射液市售對照組家兔耳靜脈血管及周圍組織可見紅腫、充血現(xiàn)象。

2??3??6?? 大鼠藥代動力學(xué)試驗?? 取健康SD大鼠72只, 雌雄各半, 體重180~ 230 g, 隨機(jī)分成兩組, 分別給予大蒜素亞微乳注射液或大蒜素注射液, 每組再隨機(jī)分成6組, 每小組采集兩個時間點。給藥前禁食12 h, 自由飲水, 按30mg /kg的劑量經(jīng)大鼠尾靜脈注射, 第1組于給藥后0??2m in, 第2組于給藥后0??5、4 m in, 第3組于給藥后1, 5 m in, 第4 組于給藥后1??5, 6 m in, 第5 組于給藥后2, 8 m in, 第6組于給藥后3, 10m in經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢取靜脈血0??4 mL, 置肝素化試管中, 迅速進(jìn)行全血樣品處理。

體內(nèi)含量測定方法: 色譜條件同制劑含量測定方法, 精密稱取大蒜素對照品適量, 加乙腈溶解制成濃度為500 ??g /mL的貯備液, 避光、冷藏保存作為對照品貯備液; 分別精密吸取大蒜素貯備液, 加乙腈依次配制1??25, 2??5, 5, 10, 25, 50 ??g /mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液, 避光、冷藏保存作為大蒜素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液; 精密稱取丙泊酚對照品30??0 mg, 加乙腈溶解制成濃度為3 000 ??g /mL的溶液, 再精密吸取

2??5mL用乙腈定容至50mL, 得溶度為150 ??g /mL的溶液, 避光、冷藏保存作為內(nèi)標(biāo)溶液。取全血300 ??L, 迅速加入內(nèi)標(biāo)200 ??L 及乙腈200 ??L, 渦

流30秒, 靜置1 m in, 于12 000 r /m in 離心5 m in,取上清液20??L 注入液相色譜儀, 記錄色譜圖, 按

內(nèi)標(biāo)法計算, 即得。自制亞微乳注射液與市售大蒜素注射液兩組試驗相比, 亞微乳的半衰期略有延長, 藥時曲線下面積AUC 略大于普通注射液, 表觀分布容積略低于注射液, 說明在同樣劑量條件下, 大蒜素亞微乳在體內(nèi)能夠維持稍長的循環(huán)時間, 使其有更多的機(jī)會達(dá)到各組織, 更好地濃集于組織細(xì)胞中達(dá)到治療效果。其相對生物利用度為122??8%, 結(jié)果見表4,圖3所示。