從青霉菌培養(yǎng)物中初步分離、純化抗氧化組份, 并對各個抗氧化組份的總抗氧化能力、DPPH· 自由基、羥自由基和超氧陰離子清除能力進行測定。青霉菌培養(yǎng)液分別用石油醚、乙酸乙酯萃取后, 水相經(jīng)HP20大孔樹脂柱層析和葡聚糖凝膠G-75柱層析, 結果表明, 其有效組分對DPPH· , · OH和O2-· 三種自由基有較好的清除能力, 且清除作用與濃度成正相關性。

　本課題組在進行香蕉果汁加工實驗時發(fā)現(xiàn), 絕大多數(shù)瓶裝果汁在放置超過半年以后, 即使是加入了抗氧化劑(維生素C、檸檬酸等)仍然會發(fā)生非酶促變色, 原有的淺橙黃色變?yōu)樽睾稚?然而卻有少數(shù)殺菌不嚴、長有某種霉菌樣生長物的果汁, 能長期保持原有顏色。提示這種霉菌樣生長物能分泌某種抗氧化物質(zhì), 具有抗非酶促變色作用和抗氧化能力。筆者從霉菌樣生長物中分離得到22個青霉菌株, 通過對青霉菌株的分離和篩選, 獲得了1株抗氧化活性較高的青霉菌菌株No.18。本實驗室從青霉菌培養(yǎng)液中初步分離、純化出抗氧化組分, 并對各個抗氧化組分的抗氧化活性及清除自由基的能力進行初步研究。這一研究有助于為通過真菌發(fā)酵開發(fā)天然抗氧化活性物質(zhì)提供新的和優(yōu)良的出發(fā)菌株。

1　材料和方法

1.1　材料與儀器

1.1.1　菌株來源

來自香蕉果汁霉菌培養(yǎng)物中分離獲得的青霉菌株, 共獲得22 株。菌種保藏采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。利用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定菌株發(fā)酵液粗提物的總抗氧化活性, 進行菌種篩選。菌株No.18 表現(xiàn)出最高的總抗氧化活性,故選定其作為供試菌種。

1.1.2　培養(yǎng)基

沙氏培養(yǎng)基, 察氏培養(yǎng)基, 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

1.1.3　試劑

DPPH(Sigma公司);總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成生物工程研究所);沙保羅氏瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司);葡聚糖凝膠G-75(北京拜爾迪生物公司);大孔樹脂HP20(日本三菱公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2　討論

微生物是產(chǎn)生天然活性化合物的天然寶庫。據(jù)估計, 現(xiàn)在已知的真菌不到總數(shù)的5% , 表明還有成千上萬的微生物種類有待進一步開發(fā) 。而且不同的生態(tài)環(huán)境下微生物的種類和數(shù)量不同, 進而也會產(chǎn)生不同的次級代謝物。青霉菌是一種潛在的活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌之一, 已報道的活性化合物就有青霉素類抗生素, 生物堿類、蒽醌類、芳香類、醇類及酯酸類等次級代謝物, 還有Vermistatin類、FuniconelikeCompound,菌素類像布雷菲得菌素等等 , 但對其產(chǎn)生的抗氧化活性物質(zhì)的研究報道很少?？寡趸瘎┦且?/span>類重要的生物活性物質(zhì), 它可以清除人體代謝過程中產(chǎn)生的自由基, 具有延緩機體衰老的功效。抗氧化劑近年來在國內(nèi)外發(fā)展很快, 用途也越來越廣, 不但可以添加在動植物油及人類食品中, 同時越來越多的抗氧化劑也用于化妝品行業(yè)。經(jīng)科學家研究發(fā)現(xiàn), 人工合成的抗氧化劑BHA(丁基羥基茴香醚)和BHT(二丁基羥基甲苯)能夠抑制人體的呼吸酶活性, 使用過量可致畸、致癌。人們把目光逐漸轉向天然抗氧化劑, 從各種動植物中提取, 如茶葉中的茶多酚、大豆中的大豆異黃酮、骨骼肌的肌肽等。具有抗氧化性質(zhì)的天然物質(zhì)結構類型主要有:黃酮、單寧、維生素類、醌、含氮化合物、植酸、香豆素、萜類和烯酸等。本實驗成功地分離鑒定出分泌強抗氧化物質(zhì)的青霉菌株, 經(jīng)初步研究, 青霉菌培養(yǎng)液水相提取物對DPPH· 、· OH和O2-· 3種自由基均有較強清除能力, 并且隨著提取物濃度的升高, 其清除自由基能力逐漸增加, 表明提取物的用量對清除自由基的能力存在量效關系, 是一種有效的自由基清除劑。

  本實驗中以甲醇相借助制備薄板層析后進行GC-MS分析, 均檢測出鄰苯二甲酸類物質(zhì)以及甲瓦龍酸內(nèi)酯(3, 5-二羥基-3-甲基戊酸內(nèi)酯)。甲瓦龍酸內(nèi)酯可能被霉菌水解成甲瓦龍酸, 而甲瓦龍酸是合成重要抗氧化物質(zhì)萜類化合物的重要前提。目前有報道甲瓦龍酸內(nèi)酯已被佳麗寶公司運用于化妝品系列,以達到肌膚美白的效果, 其機制有待探索, 而鄰苯二甲酸類物質(zhì)尚未有關抗氧化能力方面的報道。在相同濃度下, 樣品b比樣品a清除DPPH· 、· OH和O2-· 3種自由基的能力都要強, 但樣品b、樣品a與Vc比較還存在較大差距, 有待進一步純化并進而鑒定其有效成分的分子結構。

  目前對抗氧化物質(zhì)的研究所取得的進展, 讓我們看到開發(fā)天然抗氧化劑廣闊的應用前景, 以天然抗氧化劑取代化學合成的抗氧化劑是今后工業(yè)發(fā)展的趨勢, 開發(fā)實用、高效、成本低廉的天然抗氧化劑仍是研究的重點。當前對青霉菌培養(yǎng)液提取物的抗氧化物質(zhì)研究還有所欠缺, 本實驗結果為下一步確定青霉菌來源的抗氧化物質(zhì)的結構奠定了基礎, 值得進一步研究。