發(fā)酵時(shí)間對(duì)多肽得率和硫苷降解率的影響由圖1可以看出，發(fā)酵時(shí)間對(duì)多肽得率和硫苷降解率影響顯著。發(fā)酵時(shí)間為60h時(shí)，多肽得率達(dá)到最高值。這主要原因是：發(fā)酵前期，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶將菜籽蛋白水解成菜籽肽，導(dǎo)致多肽含量增加；隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，蛋白酶進(jìn)一步水解部分菜籽蛋白和菜籽肽生成游離的氨基酸，因而多肽含量有所減少[7]。菜籽粕中硫苷降解率隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而提高，在發(fā)酵72h后趨于平緩。綜上分析，最適合的發(fā)酵時(shí)間為60~72h。

2.1.2 液料比對(duì)多肽得率和硫苷降解率的影響由圖2可以看出，隨著液料比的增加，多肽得率和硫苷降解率都是先提高后降低，兩者分別在1.2∶1和1.4∶1處達(dá)到最大值。水分過(guò)低會(huì)影響菜籽粕中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解性，影響菌體的生長(zhǎng)和代謝；而水分過(guò)高，物料粘連，會(huì)降低菜籽粕的通透性，影響氣體的傳遞及物料熱量的散發(fā)，導(dǎo)致菌體氧氣的利用下降，不利于發(fā)酵。因而水分過(guò)低或者過(guò)高都會(huì)導(dǎo)致多肽得率和硫苷降解率降低。綜上分析，最適合的液料比為1.2∶1~1.4∶1。

2.1.3 接種量對(duì)多肽得率和硫苷降解率的影響由圖3可以看出，隨著接種量的增加，多肽得率和硫苷降解率都是先提高后降低，兩者在接種量為15%時(shí)均達(dá)到最大值。但是接種量對(duì)兩者的影響并不是很顯著，考慮到生產(chǎn)成本，固定接種量為15%。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)多肽得率和硫苷降解率的影響發(fā)酵溫度較低時(shí)，微生物的代謝活動(dòng)較弱，產(chǎn)酶量相對(duì)較少；而發(fā)酵溫度過(guò)高對(duì)微生物的生長(zhǎng)及代謝活動(dòng)有負(fù)面影響，也不利于其產(chǎn)酶。在適宜的溫度下，微生物生長(zhǎng)代謝活躍，產(chǎn)酶量高，有利于多肽的產(chǎn)生和硫苷的降解。由圖4可以看出，隨著發(fā)酵溫度的提高，多肽得率和硫苷降解率都是先提高后降低，兩者分別在30℃和35℃處達(dá)到最大值。綜上分析，最適合的發(fā)酵溫度為30~35℃。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化方差分析根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)了17組實(shí)驗(yàn)（含5組中心點(diǎn)重復(fù)）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。采用Design-Expert.8.0軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到多肽得率、硫苷降解率和綜合評(píng)分的二次回歸方程分別為：

Y1=-96.866+0.581A+20.556B+5.142C+0.001AB-0.010AC-0.151BC-0.002A2-6.008B2-0.069C2（R2=0.9818，R2Adj=0.9584）；

Y2=-376.86235+1.45039A+159.27832B+17.60280C-0.40526AB -0.011094AC -1.09350BC-0.00335A2-37.29495B2-0.24092C2（R2=0.9817，R2Adj=0.9582）；YOD=-15.605+0.071A+4.522B+0.714C-7.434AB-0.001AC-0.032BC-0.0002A2-1.150B2-0.010C2（R2=0.9928，R2Adj=0.9836）。

多肽得率、硫苷降解率和綜合評(píng)分回歸方程的回歸分析與方差分析結(jié)果分別如表3~表5所示。由表3可知，多肽得率模型的F值為42.01大于F0.01 （ 9，4），說(shuō)明該模型回歸顯著可靠。其R2=0.9818，R2Adj=0.9584，說(shuō)明建立的模型和實(shí)驗(yàn)擬合良好，因而能用于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)多肽的分析和預(yù)測(cè)。依F檢驗(yàn)知，各因素對(duì)多肽得率的影響由大到小依次為：發(fā)酵溫度（C）、液料比（B）、發(fā)酵時(shí)間（A），因素A、B、C、AC、A2、B2和C2的p值均小于0.01，說(shuō)明其對(duì)多肽得率影響極顯著，且各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)多肽得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，發(fā)酵時(shí)間與溫度兩者有交互作用，如圖5所示。由表4可知，硫苷降解率模型的F值為41.73大于F0.01 （ 9，4），說(shuō)明該模型回歸顯著可靠。其R2=0.9817，R2Adj=0.9582，說(shuō)明建立的模型和實(shí)驗(yàn)擬合良好，因而能用于固態(tài)發(fā)酵降解硫苷的分析和預(yù)測(cè)。依F檢驗(yàn)知，因素A、B和C的p值均小于0.01，說(shuō)明其對(duì)硫苷降解率影響極顯著；AB、BC、B2、C2的p值均小于0.05，說(shuō)明B2、C2對(duì)硫苷降解率影響顯著，且各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)硫苷降解率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，發(fā)酵時(shí)間和液料比、液料比和發(fā)酵溫度均有交互作用，如圖6所示。由表5可知，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)模型的F值為107.41大于F0.01 （ 9，4），說(shuō)明該模型回歸顯著可靠。其模型R2=0.9928，R2Adj=0.9836，說(shuō)明建立的模型和實(shí)驗(yàn)擬合良好，能用于該反應(yīng)的理論預(yù)測(cè)。依F檢驗(yàn)知，所有因素的p值均小于0.01，說(shuō)明其對(duì)發(fā)酵綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)影響極顯著，且各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，發(fā)酵時(shí)間、液料比和發(fā)酵溫度兩兩之

間均有交互作用，如圖7所示。

2.2.2 響應(yīng)面最優(yōu)條件優(yōu)化、預(yù)測(cè)和驗(yàn)證由表6可知，若以多肽得率和硫苷降解率兩者作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，所得的最優(yōu)發(fā)酵條件是不一致的，因而選用兩者的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合考慮。最終得出最優(yōu)的發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間為69.75h，液料比為1.31∶1mL/g，發(fā)酵溫度為31.36℃，此時(shí)所對(duì)應(yīng)的多肽得率、硫苷降解率理論值分別為15.95%、61.53%。為方便各實(shí)驗(yàn)條件的控制，最優(yōu)的發(fā)酵條件修正為：發(fā)酵時(shí)間為70h，液料比1.3∶1mL/g，發(fā)酵溫度為31℃。為了驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果的可靠性，在修正后的最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果由表7所示。理論以較好地預(yù)測(cè)菜籽多肽得率和硫苷的降解率。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析，采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法研究多肽得率和硫苷降解率對(duì)發(fā)酵后菜籽粕品質(zhì)的影響，得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝為：發(fā)酵時(shí)間為70h，液料比為1.3∶1，發(fā)酵溫度為31℃，此時(shí)多肽得率、硫苷降解率理論值分別為15.95%、61.53%，兩者的綜合評(píng)分達(dá)到最高值。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為15.94%、62.14%，與理論值吻合性良好。