?。壅∫轂樘剿骱锿忍闵w蕨多糖脫蛋白的最佳工藝條件，以蛋白去除率為主要考察指標，采用Ｓｅｖａｇ 法、ＴＣＡ法、酶法等５種方法對猴腿蹄蓋蕨多糖脫蛋白工藝進行了探索。結果表明：最佳脫蛋白工藝為酶法與ＴＣＡ法聯(lián)用，即加入０．０２ｇ木瓜蛋白酶，４０℃水浴反應３０ｍｉｎ后，沸水中滅酶１０ｍｉｎ，冷卻至室溫，４?。埃埃埃颍恚椋铍x心，去變性酶沉淀，取上清液加入３％ＴＣＡ 試劑振蕩３次，每次２０ｍｉｎ，震蕩后靜置１ｈ，４?。埃埃埃颍恚椋铍x心１５ｍｉｎ。在該條件下，猴腿蹄蓋蕨多糖的蛋白去除率為７６．５０％，多糖損失率為１１．８２％。通過試驗研究得到的猴腿蹄蓋蕨多糖脫蛋白工藝條件穩(wěn)定、重現(xiàn)性高，具有一定的應用價值。

［關鍵詞］猴腿蹄蓋蕨；多糖；脫蛋白工藝

　蕨類植物是植物類中草藥的重要組成部分［１］，多數(shù)蕨類植物既可食用，又可入藥。蹄蓋蕨科植物猴腿蹄蓋蕨，又名多齒蹄蓋蕨、猴腿菜、猴腿兒，既是味道鮮美的山野菜，又可作為藥品添加劑使用［２］。猴腿蹄蓋蕨在吉林省長白山區(qū)分布廣泛［３］，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等眾多功效［４］，猴腿蹄蓋蕨含有豐富的氨基酸，總含量可達１３．４６％，其中被譽為“智慧酸”的谷氨酸，含量可達２．２２％。作為藥

食兩用珍貴的山野菜，猴腿蹄蓋蕨發(fā)展前景非常廣闊［５－６］。多糖是由單糖或衍生物聚合而成的生物活性大分子，是一切生命有機體必不可少的成分。多糖具有增強免疫、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗疲勞及抗衰老等多種生物活性，已應用到保健品、化妝品、藥品、食品等領域，是現(xiàn)代醫(yī)學和食品功能化學關注的焦點［６－９］。但是，在植物多糖研究過程中，植物中所含蛋白常影響植物多糖純度，從而導致其藥理研究出現(xiàn)較大差異。蛋白質(zhì)是粗多糖中最主要的雜質(zhì)，對植物多糖的純度造成影響。蛋白質(zhì)的存在增加了多糖的吸濕性，其所帶電荷可吸附大量其他雜質(zhì)，使雜質(zhì)的去除變得更為困難。同時，蛋白質(zhì)還會吸附多糖，給多糖的分級、分離帶來困難。更重要的是，蛋白質(zhì)具有熱源性，含有蛋白雜質(zhì)的多糖不能用于臨床注射。因此，多糖純化的第一步就是脫蛋白。而一般去除蛋白質(zhì)的過程中多糖的損失量較大，所以有必要對多糖的脫蛋白方法進行研究。目前，未見猴腿蹄蓋蕨多糖相關研究的報道。筆者應用傳統(tǒng)的脫蛋白方法Ｓｅｖａｇ法、ＴＣＡ法、酶法等［１０－１４］對猴腿蹄蓋蕨多糖脫蛋白的工藝進行探索，以期為更有效地開發(fā)猴腿蹄蓋蕨提供理論依據(jù)。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 猴腿蹄蓋蕨采自吉林市蛟河地區(qū)，經(jīng)吉林化工學院藥學系薛健飛博士鑒定為蹄蓋蕨科植物猴腿蹄蓋蕨。

１．１．２ 試劑木瓜蛋白酶（酶活性為５０萬Ｕ／ｇ），北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、正丁醇、氯仿、三氯乙酸、硫酸、苯酚、無水乙醇均為分析純試劑；水為重蒸餾水。

１．１．３ 儀器ＵＶ－７５２Ｎ型紫外－可見分光光度計，（上海精密科學儀器有限公司），ＲＴ－０８型多功能粉碎機（榮聰精密科技有限公司），ＢＳ－６００Ｌ型電子天平（上海精密科學儀器有限公司），ＲＥ－５２Ａ 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

１．２ 方法

１．２．１ 多糖含量測定

１）標準曲線的繪制。精密稱取在１０５℃干燥至恒重的葡萄糖標準品２０．４ｍｇ，置于１００ｍＬ的容量瓶中［１５］，加入蒸餾水適量，超聲使溶解，蒸餾水定容至刻度，制成濃度為０．２０４ｍｇ／ｍＬ的葡萄糖標準品溶液。取上述溶液２．０ ｍＬ、４．０ ｍＬ、６．０ ｍＬ、８．０ｍＬ、１０．０ｍＬ、１２．０ｍＬ、１４．０ｍＬ，分別置于５０ｍＬ容量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度。精密吸取上述溶液各２．０ｍＬ于具塞試管中，加入４％苯酚溶液１．０ｍＬ，搖勻，迅速滴加７．０ｍＬ的濃硫酸，放置５ｍｉｎ，置于４０℃的水浴中加熱３０ｍｉｎ，迅速冷卻至室溫，采用紫外－可見分光光度計，在４９０ｎｍ波長處測定吸光度，以濃度Ｃ為橫坐標，吸光度值Ａ 為縱坐標，繪制標準曲線［１６］回歸方程：Ａ＝１１．８６５Ｃ＋０．００１?。福?，ｒ＝０．９９９　５，結果表明，葡萄糖在０．００８?。保丁埃埃担贰。玻恚纾恚膛c吸光度呈良好的線性關系。

２）樣品多糖的含量測定。取猴腿蹄蓋蕨多糖粉末適量，置于容量瓶中，加蒸餾水適量，超聲使溶解，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，制成供試品溶液。吸取供試品溶液２．０ｍＬ于具塞試管中，加入４％苯酚溶液１．０ｍＬ，搖勻，迅速滴加７．０ｍＬ的濃硫酸，放置５ｍｉｎ，置于４０℃的水浴中加熱３０ｍｉｎ，迅速冷卻至室溫，采用紫外－可見分光光度計，在４９０ｎｍ波長處測定吸光度，由回歸方程計算出多糖濃度，從而計算出粉末中多糖的質(zhì)量以及多糖損失率。多糖質(zhì)量（ｇ）＝（Ｃ×１０×２５×１００×干浸膏質(zhì)量）／１０００×２×２×含量測定取樣量；多糖損失率（％）＝（粗多糖中多糖質(zhì)量－除蛋白處理后樣品中多糖質(zhì)量）／粗多糖中多糖質(zhì)量；式中，Ｃ 表示測定樣液中多糖的濃度（ｍｇ／ｍＬ）。

１．２．２ 蛋白質(zhì)含量測定吸取多糖提取液１．０ｍＬ定容于２５ｍＬ容量瓶，以蒸餾水為空白，在２８０ｎｍ和２６０ｎｍ處測定吸光度值，根據(jù)經(jīng)驗公式：蛋白質(zhì)濃度Ｃ（ｇ／Ｌ）＝１．４５×Ａ２８０－０．７４×Ａ２６０［１７－１８］，計算蛋白質(zhì)含量，從而計算去除率。

蛋白去除率（％）＝（粗多糖中蛋白質(zhì)量－除蛋白處理后樣品中蛋白質(zhì)量）／粗多糖中蛋白質(zhì)量

１．３ 脫蛋白試驗

１．３．１ Ｓｅｖａｇ法脫蛋白試驗［１９－２０］

取猴腿蹄蓋蕨粗多糖溶液２５ｍＬ，加入一定量的Ｓｅｖａｇ試劑（Ｖ正丁醇∶Ｖ氯仿，１／５），進行幾次一定時間的劇烈震蕩后，４?。埃埃埃颍恚椋铍x心，取上清液即可。Ｓｅｖａｇ試劑加入量、震蕩次數(shù)和震蕩時間通過以下考察試驗進行確定。

１）Ｓｅｖａｇｓ試劑加入量。Ｓｅｖａｇ試劑體積／多糖溶液體積分別為１／１、１／２、１／３、１／４、１／５，固定震蕩時間為２０ｍｉｎ，震蕩次數(shù)為１次，考察Ｓｅｖａｇｓ試劑加入量對多糖損失率和蛋白去除率的影響。

２）震蕩次數(shù)。改變震蕩次數(shù)（１次、２次、３次、４次、５次），固定Ｓｅｖａｇ試劑為５ｍＬ，震蕩時間為２０ｍｉｎ，考察震蕩次數(shù)對多糖損失率和蛋白去除率的影響。

３）震蕩時間。改變震蕩時間（１０ｍｉｎ，２０ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，４０ｍｉｎ，５０ｍｉｎ），固定Ｓｅｖａｇ試劑為５ｍＬ，震蕩次數(shù)為１次，考察震蕩時間對多糖損失率和蛋白去除率的影響。

１．３．２ 三氯乙酸法（ＴＣＡ 法）脫蛋白試驗取猴腿蹄蓋蕨粗多糖溶液２５ｍＬ，分別加入ＴＣＡ 溶液使其質(zhì)量分數(shù)分別為２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％，振蕩２０ ｍｉｎ，靜置１ｈ，４?。埃埃埃颍恚椋铍x心１５ｍｉｎ，棄去沉淀?？疾烊芤褐胁煌裕茫?濃度的脫蛋白效果。確定最佳的ＴＣＡ 濃度后，在該條件下考察ＴＣＡ 法不同震蕩次數(shù)（１次、２次、３次、４次、５次）下的脫蛋白效果，計算蛋白去除率和多糖損失率。

１．３．３ 酶法脫蛋白試驗取猴腿蹄蓋蕨粗多糖溶液２５ｍＬ，放入水浴鍋中預熱１０ｍｉｎ，加入一定量的木瓜蛋白酶，在一定溫度下酶解反應一段時間后，４０℃水浴反應３０ｍｉｎ后，沸水中滅酶１０ｍｉｎ，冷卻至室溫，４　０００ｒ／ｍｉｎ離心，去變性酶沉淀，取上清液

即可。木瓜蛋白酶加入量、酶解溫度、酶解時間通過以下考察試驗進行確定。

１）木瓜蛋白酶加入量。分別加入木瓜蛋白酶量０．０１ｇ、０．０２ｇ、０．０３ｇ、０．０４ｇ、０．０５ｇ，固定酶解溫度為４０℃，酶解時間為０．５ｈ，考察木瓜蛋白酶加入量對多糖損失率和蛋白去除率的影響。

２）酶解溫度。改變酶解溫度（４０℃，４５℃，５０℃，５５℃，６０℃，６５℃）， 固定蛋白酶加入量０．０２ｇ，酶解時間為０．５ｈ，考察酶解溫度對多糖損失率和蛋白去除率的影響。

３）酶解時間。改變酶解時間（０．５ｈ，１．０ｈ，１．５ｈ，２．０ｈ，２．５ｈ），固定蛋白酶加入量０．０２ｇ，酶解溫度為４０℃，考察酶解時間對多糖損失率和蛋白去除率的影響。

１．３．４ 酶法與Ｓｅｖａｇ法聯(lián)用脫蛋白試驗取猴腿蹄蓋蕨粗多糖溶液２５ ｍＬ，放入水浴鍋中預熱１０ｍｉｎ，在優(yōu)選的木瓜蛋白酶法工藝條件下進行脫蛋白后，將反應瓶放入沸水中滅酶１０ｍｉｎ，冷卻至室溫，４?。埃埃埃颍恚椋铍x心，去變性酶沉淀，取去蛋白后的猴腿蹄蓋蕨多糖上清液２０ｍＬ，在優(yōu)選的Ｓｅｖａｇ法條件下進行脫蛋白試驗，測定其多糖及蛋白質(zhì)含量，計算多糖損失率和蛋白去除率。

１．３．５ 酶法與ＴＣＡ 法聯(lián)用脫蛋白試驗取猴腿蹄蓋蕨粗多糖溶液２５ ｍＬ，放入水浴鍋中預熱１０ｍｉｎ，在優(yōu)選的木瓜蛋白酶法工藝條件下進行脫蛋白后，將反應瓶放入沸水中滅酶１０ｍｉｎ，冷卻至室溫，４?。埃埃埃颍恚椋铍x心，去變性酶沉淀，取去蛋白后的上清液２０ｍＬ，在優(yōu)選的ＴＣＡ法條件下進行脫蛋白試驗，得脫蛋白多糖溶液，測定其多糖及蛋白質(zhì)含量，計算多糖損失率和蛋白去除率。