載體膜的制備

稱取CA 0. 5 g , 溶于10 mL C1液中。放置一定時間, 防止氣泡產(chǎn)生。加入2. 0 g HDA, 待完全溶解, 放置一定時間, 使氣泡消失。邊攪拌邊逐滴加入同體積的C2 液。迅速將溶液傾倒于100 cm2模具中, 讓其自然成膜。放入柜子中, 其上加蓋濾紙。約4 h 后觀察, 并適當(dāng)劃膜, 以防膜裂開。室溫下放置7 d

載體膜的抗體包被

1. 4. 1 偶聯(lián)抗體從模具中取出CA-GA-HDA 膜,修剪成規(guī)格為40 mm  40 mm 的膜片, 用三蒸水洗滌3 次( 可用100 mL/ L 的鹽酸羥胺浸泡2 h) , 浸入50 mL/ L 的戊二醛溶液中, 室溫反應(yīng)24 h, 取出后用三蒸水清洗數(shù)次。浸入含1400 以上效價抗體的磷酸鹽緩沖液( pH 8. 0, 0. 1 mol/ L) 中, 37  浸泡2h( 或4  , 24 h) , 用磷酸鹽緩沖液( pH 8. 0, 0. 1mol/ L) 清洗3 次。

1. 4. 2 封閉將抗體膜用2. 5 mL/ L 的BSA 溶液37 封閉1 h( 或4  , 24 h) , 按上法清洗。將膜于

4  下保存在0. 01 mol/ L, pH 7. 0 的磷酸鹽緩沖液中( 可保存半年) 。

1. 5 抗原的酶標(biāo)記

稱取1. 12 mg 鹽酸克倫特羅、10. 00 mg( 約4 104U ) 過氧化氫酶, 溶于3 mL( 0. 05 mol/ L, pH 9. 7)碳酸鹽緩沖液中, 然后加入10 mL/ L 的戊二醛100L, 在25 條件下放置30 min。用超濾法粗提取,再用Sephadex-G200 純化, 然后用0. 05 mol/ L、pH7. 0 的PBS 洗脫, 收集純化物備用。

1. 6  感受器部件的性能測試[ 6, 7]

1. 6. 1  質(zhì)控將抗體膜固定于電極表面, 用O型圈固定此透氧膜, 電極中注入0. 5 mol/ L 的KCl作為電解液, 而后將電極插入PBS 中, 測定空白膜的電流( A) 值, 并記錄4 min 內(nèi)電流值的變化情況。取出電極, 在膜上加100 L 過氧化氫酶標(biāo)鹽酸克倫特羅( CATase-CLB) , 室溫作用15 min。用0. 1 mol/ L, pH 7. 0 的PBS 液沖洗膜。將電極插入含H2O2的基質(zhì)液( PBS 100 mL+ 30 mL/ L H2O2200 L) 中, 記錄24 min 內(nèi)電流值的情況。

1. 6. 2 測試取另一張抗體膜進(jìn)行測試。?? 取出電極, 在膜上加100 L CATase-CLB 和100 LCLB 系列標(biāo)準(zhǔn)品( 0、0. 1、0 . 3、0. 9、2. 7、8. 1 g/ L) ,室溫作用15 min。沖洗膜。同1. 6. 1 之, 并與上一個膜進(jìn)行比較。 重復(fù)上述質(zhì)控和測試過程10 次, 對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2. 1 感受器部件的效果和性能

感受器部件對反應(yīng)體系中信號變化( H2O2的減少量) 感受效果的測定結(jié)果見表1。質(zhì)控膜和測定膜的基底值差異不顯著( P > 0. 05) , 而電流的凈變

化值差異顯著。測定值與基底值相比均降低。

2. 2  最低檢測限

以不同濃度梯度的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品, 即0、0. 1、0. 3、0. 9、2. 7、8 . 1 g/ L 進(jìn)行測試, 結(jié)果在0. 3g/ L 時即有可感受和顯示的電流出現(xiàn), 所以初步確定本測定體系的最低檢測限為0. 3 g/ L。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)的結(jié)果表明, 質(zhì)控膜和測定膜的基底值

差異不顯著( P> 0. 05) , 說明膜的均一性符合標(biāo)準(zhǔn)適合進(jìn)行后續(xù)的工作。而質(zhì)控膜和測定膜的電流凈變化值差異顯著( P < 0. 05) , 測定值與基底值相比均有較大差異, 最低檢測限可達(dá)0. 3 g/ L, 說明此感受器部件的靈敏度較高, 分子識別和信號的傳導(dǎo)能力較好。由此證實(shí), 免疫傳感器的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)和最難的部分研制成功, 從而為整個傳感器的研制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。