三聚氰胺人工抗原的合成

1.2.1 節(jié)合成的半抗原MEA 和MEB中的活性基團(tuán)羧基與生物大分子蛋白中的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，參照文獻(xiàn)[9-11]的方法并加以改進(jìn)，將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)合成完全抗原，其中用于動(dòng)物免疫的稱為免疫原，用于免疫分析的稱為包被原。為避免載體蛋白之間的交叉反應(yīng)，免疫原與包被原需要采用不同的載體蛋白[ 12 ]，合成免疫原一般采用BSA、包被原一般采用OVA。

1.2.2.1 人工免疫原的合成

采用EDC (碳二亞胺) 法將合成的半抗原MEA 與載體蛋白BSA 相偶聯(lián)，制備三聚氰胺人工免疫抗原，合成路線見圖4 。準(zhǔn)確稱取24.26mg MEA 溶于 3mL 碳碳二甲基甲酰胺(DMF)中，加入38.34mg 乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺(EDC)和23.02mg NHS，在室溫磁力攪拌條件下反應(yīng)24h。3000r/min 離心反應(yīng)液10min，棄去沉淀，上清液為反應(yīng)液A。另稱取60mg BSA 溶于7mL、pH7.2 PBS緩沖液中，此為反應(yīng)液B。將反應(yīng)液B 置于磁力攪拌器上，室溫條件下將反應(yīng)液A 緩慢滴加到反應(yīng)液B 中，4℃攪拌反應(yīng)過夜。次日將反應(yīng)液置于處理過的透析袋內(nèi)[13]，PBS 中透析3d，除去小分子成分，進(jìn)行偶聯(lián)蛋白的初步純化。偶聯(lián)產(chǎn)物命名為MEA-BSA，透析后冷凍干燥，分裝所得的固體，于－ 2 0℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.2.2 人工包被原的合成

采用氯甲酸異丁酯法(又稱混合酸酐法)將合成的半抗原MEB 與載體蛋白OVA 相偶聯(lián)，制備三聚氰胺包被原，合成路線見圖5 。準(zhǔn)確稱取24.26mg MEB 溶解于3mL DMF 中，室溫磁力攪拌條件下加入27μL三乙胺和36μL氯甲酸異丁酯，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h 以上，反應(yīng)終液置冰箱冷藏溫度4℃條

件下冷卻1h 以上，經(jīng)3000r/min 離心15min，取上清液(即活潑酯液)，此為反應(yīng)液A。另稱取50mg OVA 溶于7mL 碳酸鹽緩沖液(0.05mol/L，pH9.6)中，放入冰箱中預(yù)冷，此為反應(yīng)液B。在室溫?cái)嚢钘l件下將反應(yīng)液A 緩慢滴加到反應(yīng)液B 中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)6h 。次日將反應(yīng)液置于處理過的透析袋內(nèi)，4℃冰箱透析3d，每天至少換液3 次，偶聯(lián)產(chǎn)物命名為MEB-OVA。透析后冷凍干燥，分裝所得的固體，于－ 2 0 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.3 人工抗原的蛋白質(zhì)量濃度和偶聯(lián)比測(cè)定

1.2.3.1 人工抗原的蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定

透析后的蛋白液里同時(shí)存在蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、半抗原- 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物3 種物質(zhì)，因此要測(cè)定該液體內(nèi)蛋白的質(zhì)量濃度以便估算偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。考馬斯亮藍(lán)染色法[ 14 ]，具有靈敏度高，測(cè)定快速、簡(jiǎn)便、干擾物質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，是測(cè)定蛋白濃度最為常用的方法，本實(shí)驗(yàn)將透析結(jié)束后的反應(yīng)液用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定偶聯(lián)物的蛋白濃度，并結(jié)合紫外掃描的圖譜計(jì)算出偶聯(lián)比。

1.2.3.2 人工抗原的偶聯(lián)比測(cè)定

常用的人工抗原偶聯(lián)比的測(cè)定方法是紫外光譜法[15]。本實(shí)驗(yàn)以紫外分光光度法測(cè)定OD 值，計(jì)算偶聯(lián)比。將三聚氰胺半抗原、人工抗原和載體蛋白分別配成質(zhì)量濃度為0.02、0.3、0.3mg/mL的溶液，在波長(zhǎng)190～400nm處分別掃描其紫外吸收光譜，選擇在波長(zhǎng)253.5nm 處測(cè)定各光密度值，半抗原與載體蛋白偶聯(lián)比計(jì)算公式如下：式中：OD 為光密度值；M 為相對(duì)分子質(zhì)量；ρ為質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的鑒定

2.1.1 熔點(diǎn)測(cè)定結(jié)果分析

在常壓室溫條件下，對(duì)MEA、MEB 兩種合成產(chǎn)物分別進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定，采用數(shù)顯顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定它們的熔點(diǎn)范圍分別為190～195℃和131～135℃，據(jù)產(chǎn)品介紹，2- 氯-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪的熔點(diǎn)為320℃，6- 氨基己酸熔點(diǎn)為204～207℃，對(duì)氨基苯甲酸的熔點(diǎn)為187～188℃，另外參與反應(yīng)的其他物質(zhì)為液體。由此可見，兩個(gè)合成反應(yīng)均有新物質(zhì)生成。

2.1.2 薄層層析TLC 監(jiān)測(cè)結(jié)果分析

在層析硅膠板上點(diǎn)樣3 種物質(zhì)，選擇乙酸乙酯、石油醚、醋酸(體積比1:1:0.2)為展開劑，產(chǎn)物經(jīng)薄層色譜TLC 監(jiān)測(cè)，結(jié)果見圖6 。從左到右第1 點(diǎn)為原反應(yīng)物2- 氯-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪，第2 點(diǎn)是原反應(yīng)物與6- 氨基己酸反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)；第3 點(diǎn)是原反應(yīng)物與對(duì)氨基苯甲酸反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)，多次實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)同樣結(jié)果。因?yàn)樾律晌镔|(zhì)分子質(zhì)量比原反應(yīng)物分子質(zhì)量大，其遷移速度慢，遷移率小，所以出現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明，在反應(yīng)后生成了不同于原反應(yīng)物(Rf=0.76)的新產(chǎn)物：第2 個(gè)點(diǎn)Rf=0.16、第3 個(gè)點(diǎn)Rf=0.15。

2.1.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果分析

由圖7 可見，最高峰值物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為241.16，表明產(chǎn)生的新化合物相對(duì)分子質(zhì)量為241.161，與目標(biāo)產(chǎn)物的理論相對(duì)分子質(zhì)量(240.26)基本一致，說明合成的新物質(zhì)與目標(biāo)物化合物相符，即半抗原MEA 合成成功。由圖8 可見，最高峰值物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為247.12，表明產(chǎn)生的新化合物相對(duì)分子質(zhì)量為247.12，與目標(biāo)產(chǎn)物的理論相對(duì)分子質(zhì)量(246.19)基本一致，說明合成的新物質(zhì)與目標(biāo)化合物相符，即半抗原MEB 合成成功。

2.2 人工抗原的鑒定

半抗原與載體蛋白均具有各自的紫外吸收特征，因此其偶聯(lián)物兼具有二者的紫外吸收特征，根據(jù)紫外吸光度的加和性原理，通過紫外掃描可以判斷人工抗原是否偶聯(lián)成功。本實(shí)驗(yàn)將半抗原MEA、MEB、人工抗原MEA-BSA、MEB-OVA 和載體蛋白BSA、OVA 分別配成質(zhì)量濃度為0.01、0.2、0.2mg/mL的溶液，分別在220～400nm 波長(zhǎng)處掃描，根據(jù)其紫外吸收強(qiáng)度，確定是否有吸收峰的疊加，結(jié)果見圖9 、1 0 。由圖9 可見，反應(yīng)產(chǎn)物的吸收峰是底物MEA和BSA吸收峰的疊加，說明反應(yīng)產(chǎn)物是MEA 和BSA 的結(jié)合物，表明偶聯(lián)成功，MEA 已成為BSA 的一個(gè)特征結(jié)構(gòu)即抗原決定簇，免疫原合成成功由圖10 可見，反應(yīng)產(chǎn)物的吸收峰是底物MEB 和OVA 吸收峰的疊加，說明反應(yīng)產(chǎn)物是MEB 和OVA 的結(jié)合物，表明偶聯(lián)成功，MEB 已成為OVA 的一個(gè)特征結(jié)構(gòu)即抗原決定簇，包被原合成成功。

2.3 人工抗原的蛋白質(zhì)量濃度和偶聯(lián)比

分別根據(jù)1.2.3.1 節(jié)和1.2.3.2 節(jié)的方法測(cè)定偶聯(lián)物的蛋白質(zhì)量濃度并計(jì)算半抗原和載體蛋白的偶聯(lián)比，結(jié)果如表1 所示。人工抗原的偶聯(lián)比表示半抗原結(jié)合在載體蛋白上的數(shù)量，數(shù)量越大，所攜帶的抗原決定簇越多，單位質(zhì)量的免疫原中所攜帶的抗原決定簇越多，越容易刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。由表1 可見，本實(shí)驗(yàn)成功制備了三聚氰胺人工免疫原和人工包被原，半抗原與載體蛋白偶聯(lián)比分別為25.28:1(MEA-BSA)和13.11:1(MEB-OVA)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物引入羧基，與載體蛋白的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生的人工抗原具有和三聚氰胺相同的抗原決定簇。為更好地被免疫活性細(xì)胞所識(shí)別，合成的免疫原具有較長(zhǎng)的6 個(gè)碳的連接臂(－(CH2)5COOH)，合成的包被原具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的連接臂，這樣豐富了半抗原的特征結(jié)構(gòu)，達(dá)到強(qiáng)化抗原決定簇的目的。采用不同的半抗原偶聯(lián)制備免疫原與包被原，可以有效地減少偶聯(lián)位點(diǎn)的相似結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的交叉反應(yīng)，以提高抗體與被檢測(cè)物質(zhì)的相對(duì)親和力，降低最低檢出限，提高檢驗(yàn)的靈敏度。