摘 要：目的：建立三聚氰胺殘留的免疫分析方法。方法：以三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物2- 氯-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪為原料，分別與6- 氨基己酸和對氨基苯甲酸，各經(jīng)兩步化學(xué)反應(yīng)合成兩種具有不同長度間隔臂的半抗原MEA 和MEB，并分別通過碳二亞胺法和混合酸酐法將MEA和MEB 與牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，制備三聚氰胺的免疫原(MEA-BSA)和包被原(MEB-OVA)。結(jié)果：經(jīng)質(zhì)譜和紫外光譜表征，證明所合成的產(chǎn)物為目標(biāo)半抗原MEA和MEB，并且與載體蛋白偶聯(lián)比可達(dá)到25.28:1(MEA-BSA)和13.11:1(MEA-OVA)。結(jié)論：半抗原MEA和MEB 及人工抗原合成成功。

關(guān)鍵詞：三聚氰胺；半抗原；人工抗原

自2 0 0 8 年發(fā)生“三鹿奶粉”事件以來，“三聚氰胺”一詞已成為家喻戶曉、婦孺皆知的化學(xué)物質(zhì)。三聚氰胺并不是食品原料，不允許添加到乳及乳制品中，在乳中違法添加該物質(zhì)，主要是為了虛增乳中蛋白質(zhì)含量[1]，牟取不法利益。對食品中非法添加物的控制除了建立嚴(yán)格的監(jiān)管機(jī)制外，快速、靈敏的現(xiàn)場檢驗(yàn)方法與檢驗(yàn)工具是遏制食品摻假、摻雜的重要手段。為此，需要建立一種方便快捷、靈敏度高的三聚氰胺檢測方法，以遏制奶類食品中三聚氰胺的添加現(xiàn)象。

目前，常用的三聚氰胺殘留檢測方法是色譜分析法[2-3]，而免疫分析法[4]相對較少，市場上用于商業(yè)檢測的試劑盒以國外進(jìn)口產(chǎn)品為主，國內(nèi)的產(chǎn)品最低檢出限較高，給現(xiàn)場分析帶來了一定的難度。為此，筆者擬采用免疫原和異源包被原進(jìn)行免疫化學(xué)檢驗(yàn)，以提高抗體與被檢物質(zhì)的相對親和力，降低最低檢出限，提高檢驗(yàn)的靈敏度。本實(shí)驗(yàn)采用三聚氰胺的結(jié)構(gòu)類似物，以6- 氨基己酸、對氨基苯甲酸為間隔臂與載體蛋白偶聯(lián)制備不同的人工抗原，為三聚氰胺檢驗(yàn)試劑盒的制備提供免疫原和包被原。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

三聚氰胺、6- 氨基已酸、對氨基苯甲酸、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸(EDC·HC1) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2- 氯-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪(純度97%)上海西域機(jī)電系統(tǒng)有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、N- 羥基琥珀酰亞胺(NHS) 美國 Sigma公司；三乙胺(化學(xué)純) 北京益利精細(xì)化工品有限公司；氯甲酸異丁酯(純度＞ 98%) 力得士化工北京業(yè)務(wù)部；12000～14000D 透析袋北京拜爾迪有限公司。ZAB-HS 質(zhì)譜儀英國 VG公司；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器德國IKA 公司； ZF-C 三用紫外分析儀、756PC 型紫外- 可見分光光度計(jì)上海雷磁新涇儀器有限責(zé)任公司；X-4 數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測定儀北京泰克儀器有限公司；722S 分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；LGJ-10 冷凍干燥機(jī)北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；ROTINA-35高速離心機(jī)德國 Hettich Gmbh 公司。

1.2 方法

1.2.1 三聚氰胺半抗原的合成

三聚氰胺的分子結(jié)構(gòu)見圖1A，其類似物2- 氯-4,6-二氨基-1,3,5- 三嗪分子結(jié)構(gòu)見圖1B，由圖1A、圖1B可見這兩種物質(zhì)結(jié)構(gòu)基本相似，僅在2 位以氯取代了氨基，因此采用6- 氨基己酸和對氨基苯甲酸可以在2 位形成含有羧基的化合物如圖1C、圖1D 所示，以羧基與載體蛋白的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生的人工抗原將具有和三聚氰胺相同的抗原決定簇。

1.2.1.1 半抗原MEA 的合成

以2- 氯-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪為原料，在強(qiáng)堿性條件下與6 - 氨基己酸反應(yīng)合成半抗原[ 5- 6]，合成路線見圖2 。準(zhǔn)確稱取2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪3g(20.61mmol)和6- 氨基己酸2.7g(20.61mmol)置于250mL 圓底燒瓶中，加入150mL 蒸餾水加熱攪拌溶解，待加熱回流1～2h 后

再滴入2mol/L 氫氧化鈉溶液30mL，繼續(xù)加熱回流4.5h，反應(yīng)過程中采用薄層色譜(TLC)[7]監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。冷卻至室溫后加入1.2mol/L鹽酸溶液20mL，即有大量白色沉淀出現(xiàn)，將沉淀過濾，置于蒸發(fā)皿中，蒸發(fā)烘干得粗產(chǎn)物，命名為2-(氨基己酸)-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪(MEA)，稱質(zhì)量為2.26g，產(chǎn)率為39.7%。稱取粗產(chǎn)物1g，用三蒸水加熱進(jìn)行洗滌、過濾，重復(fù)3 次，干燥后得白色粉末64.91mg，產(chǎn)率為64.91%。合成產(chǎn)物用數(shù)顯顯微熔點(diǎn)儀測定熔點(diǎn)，以確定產(chǎn)物的純度；再通過質(zhì)譜分析法[8]鑒定，以確定產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量，從而判斷合成產(chǎn)物是否為目標(biāo)產(chǎn)物MEA。

1.2.1.2 半抗原MEB 的合成

以2- 氯-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪為原料，在強(qiáng)堿性條件下與對氨基苯甲酸反應(yīng)合成半抗原[5-6]， 合成路線見圖3 。準(zhǔn)確稱取2- 氯-4,6- 二氨基-1,3 ,5- 三嗪600mg(4.12mmol)和對氨基苯甲酸565mg(4.12mmol)置于250mL圓底燒瓶中，加入80mL 蒸餾水加熱攪拌溶解，待加熱回流1～2h 后再滴入2mol/L 氫氧化鈉溶液18mL，繼續(xù)加熱回流4.5h，反應(yīng)過程中采用薄層色譜(TLC)[7]監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。冷卻至室溫后加入1.2mol/L 鹽酸溶液15mL，邊滴邊攪拌并開始出現(xiàn)白色絮狀混濁物，直至pH 值為5～6 時(shí)出現(xiàn)大量白色沉淀，將過濾所得沉淀物置于蒸發(fā)皿中，蒸發(fā)烘干得粗產(chǎn)物，命名為2 - ( 氨基苯甲酸)-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪(MEB)，稱質(zhì)量為281.4mg，產(chǎn)率為46.9%。稱取粗產(chǎn)物100mg，用三蒸水加熱進(jìn)行洗滌、過濾，重復(fù)3 次，干燥后得白色粉末68.8mg，產(chǎn)率為68.8%。合成產(chǎn)物用數(shù)顯顯微熔點(diǎn)儀測定熔點(diǎn)，以確定產(chǎn)物的純度；再通過質(zhì)譜分析法鑒定[8]，以確定產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量，從而判斷合成產(chǎn)物是否為目標(biāo)產(chǎn)物MEB。